Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп. Конфокальная микроскопия – принципы действия и примеры использования

4 июня 2013

Значительная часть проводимых на биологическом факультете МГУ научных исследований, успешная реализация тесно связанных с ними образовательных программ, немыслимы без применения самой современной микроскопической техники. В рамках Программы развития Московского университета на биологическом факультете была создана, полностью оснащена необходимым оборудованием и эффективно работает межкафедральная лаборатория конфокальной микроскопии.

Фибробласты 3Т3 на стенках макропоры матрикса

Текст: Третьяков Артемий

Что может делать?

С помощью конфокального микроскопа можно получить несколько изображений виртуальных срезов клетки, или же собранную из них трехмерную модель. Такие возможности дает лазер, луч которого можно фокусировать в любой точке клетки. Для получения изображения объект должен быть флуоресцентно активен, то есть при попадании луча лазера он (а точнее, определенные молекулы в его составе) должен испускать свет с большей длиной волны, чем попадающий на него, который и улавливается микроскопом. Изображение строится как раз на основе этой флуоресценции.

Фото

Как работает?

«Современный уровень развития фундаментальных и прикладных междисциплинарных научных исследований, а также задачи подготовки специалистов, обладающих междисциплинарными компетенциями, требуют интенсивного развития и модернизации материально-технической базы» (Программа развития Московского университета, стр. 5 ;).

Кроме лазера в состав электронномеханического устройства входит также оптический фильтр, пропускающий луч лазера, но отражающий более длинноволновый свет на диафрагму, называемую «пинхолом» (от англ. Pinhole – проделанная булавкой дырка, дословный перевод отлично характеризует устройство пинхола), которая отсекает весь ненужный фоновый свет и тем самым снижает или вовсе сводит на нет влияние нижележащих оптических слоев на четкость отображения сканируемого участка клетки. Если бы фоновый свет не отсекался пинхолом, то оптические слои накладывались бы друг на друга и мешали наблюдателю – будто бы он смотрит сквозь листву вдаль. За диафрагмой располагается фотоприемник, оцифровывающий получаемую информацию.

Понятно, что такое «точечное» сканирование требует времени. Чтобы ускорить этот процесс в конфокальной системе используется еще один модуль, называемый спиннинг-диском, позволяющий за один акт работы лазера получить изображение не одной точки, а целой линии.

Патент на такую систему был получен в 1961 году профессором Массачусетского технологического института Марвином Минским. Активное ее использование началось в 80-х годах, а сейчас конфокальная микроскопия переживает свой расцвет. В России первый микроскоп появился в 2003 году, это был Axiovert 200M LSM510 Meta. За ним последовали другие, и теперь в нашей стране существует несколько крупных лабораторий, в числе которых и межкафедральная лаборатория на биологическом факультете МГУ. В распоряжении лаборатории пять микроскопов, в том числе: Olympus FV10i, Zeiss LSM710, Nicon Eclipse Ti-EAL.

Конфокальная микроскопия добилась не только высочайшего контраста и трехмерности, она освоила и четвертое измерение – время, позволив изучать изменения, происходящие в клетках. Для этих целей каждая установка снабжена системами поддержания их жизни. Все это дает широкие возможности для исследователей, которые этими возможностями с успехом пользуются.

И, раз уж речь идет о лаборатории биологического факультета МГУ, в качестве примеров следует упомянуть проведенные в этой лаборатории исследования.

Шелк и паутина

Конфокальная микроскопия добилась не только высочайшего контраста и трехмерности, она освоила и четвертое измерение – время, позволив изучать изменения, происходящие в клетках.

Одной из интересных работ является создание биодеградируемых протезов для восстановления сосудов и других полых органов. Такие тканеинженерные конструкции внешне представляют собой, в наиболее простых случаях, трубки или пленки, надевающиеся на место повреждения и выполняющие, таким образом, роль «заплатки». Их можно изготовить из разных материалов, в том числе из фиброина шелка коконов шелкопряда. Достоинство этого материала в том, что он стабилен и формирует гибкую и прочную структуру протеза. Сам протез выглядит как пленка только при рассмотрении невооруженным глазом, на самом деле он представляет собой матрикс - сетчатую многослойную основу, каркас, имитирующий строение живой ткани. Этот каркас помогает новым клеткам занять правильное положение, обеспечивая их равномерное распределение. В результате поврежденная стенка органа восстанавливается, а ставший ненужным каркас подвергается биодеградации. Но проверить, насколько равномерно распределяются по каркасу клетки, а также хорошо ли им живется в глубоких слоях матрикса (нет ли затруднений в газообмене и обмене продуктами метаболизма), и не изменяют ли они при проникновении внутрь него морфологии, не так-то просто. Именно на этом этапе применение микроскопа (Zeiss Axiovert 200M LSM 510) сильно упростило задачу. В основном за счет возможности исследовать объект без разрушения, а также за счет способности микроскопа смотреть внутрь матрикса на глубину до 600 мкм.

Фото

Похожие работы были проведены и с костной тканью, матрикс для которой изготавливали как из того же фиброина, так и из спидроина - белка, изначально обнаруженного в организме паука и использующегося им для плетения паутины. В лабораторных условиях белок производят совсем не пауки, а дрожжи, в чей геном внедрен немного измененный ген паука, ответственный за синтез этого белка.

Не все так просто

Но, если возникновение повреждений в тканях – процесс простой и понятный, другие патологии понятны далеко не всегда. И прежде чем начать эффективное лечение и, тем более, предотвращение их развития, нужно выяснить механизм их возникновения. К числу таких относится атеросклероз - болезнь артерий, в результате которой в стенке сосуда, а точнее, в интиме – ее внутреннем слое, накапливаются липиды, делающие стенку толще, что в конечном итоге может привести даже к полной закупорке сосуда. Из-за чего возникает это заболевание, не совсем понятно, как и непонятно то, какую роль играют иммунокомпетентные клетки, в местах скопления которых вскоре начинается атерогенез. Полноценные ответы на эти вопросы еще не найдены, но изучение атерогенеза продолжается, хоть и публикаций на эту тему куда меньше, чем на тему тканеинженерных протезов.

Фото

Судьбы молекул

Межкафедральную лабораторию конфокальной микроскопии регулярно используют в своей работе более 20 студентов и аспирантов с почти 10 кафедр.

В описанных выше исследованиях в основном отслеживается состояние клеток. Но этим возможности конфокального микроскопа не ограничены, он вполне способен отследить даже судьбу отдельной молекулы в клетке – лишь бы она обладала флуоресцентной активностью. Для этого молекулы обычно метят флуорохромами – специальными красителями, имеющими эту активность. Флуорохромы существуют в виде отдельных молекул, и мечение ими заключается в химическом связывании флуорохрома с интересующей исследователя молекулой. После этого такие меченые молекулы попадают в клетку и их дальнейшую судьбу отслеживают при помощи микроскопа. Таким способом сравнивали, например, активность и перемещения в клетке рицина и вискумина. Оба вещества – белковые токсины, оба имеют растительное происхождение и состоят из двух частей – субъединиц, одна из которых ответственна за связывание с клеткой и проникновение внутрь, а другая – за инактивацию рибосомы, что в конечном итоге ведет к гибели клетки. Практическая польза опять же связана с лечением еще одного опасного заболевания – рака. Такое четкое «разделение обязанностей» между субъединицами позволяет заменить первую субъединицу, например, на антитело. Получится «иммунотоксин», действующий только на определенные клетки, к которым это антитело подойдет. Основных проблем две. Первая: выбор антитела, которое будет подходить к раковым клеткам и не допускать проникновения токсина в здоровые. И вторая: выбор токсина, который при превращении в иммунотоксин будет сохранять высокую эффективность.

Фото : Первичная культура клеток сердца новорожденных крысят: А - контроль, Б - обработанных 20мкМ изопротеренола в течении суток. 1 - окраска митохондрий TMRE; 2 - фазовый контраст. Шкала 10мкм. (Смирнова Т.А., Сапрунова В.Б. "Адаптационные изменения митохондрий культивируемых кардиомиоцитов новорожденных крысят под воздействием изопротеренола". Международная конференция "Рецепторы и внутриклеточная сигнализация" 24-26 МАЯ 2011г. Пущино).

Обучение

Список проведенных с использованием конфокальной микроскопии работ можно продолжать долго. Эффективный метод, к тому же позволяющий работать с живыми клетками, востребован практически в любом научном исследовании. И поэтому огромную роль играет подготовка студентов к работе в этой лаборатории. Регулярно ее посещают более 20 студентов и аспирантов, занимающихся курсовыми, предкурсовыми и дипломными работами.

Работают на установках эмбриологи, молекулярные биологи, цитологии, биоинженеры, иммунологи, зоологи.

Лаборатория конфокальной микроскопии основана в 2004 году.

Заведующий лабораторией – доцент М.М.Мойсенович

В лаборатории работают молодые специалисты А.А.Рамонова и А.Ю.Архипова

В настоящее время в лаборатории установлены 2 конфокальные системы:

• Axiovert 200M с конфокальной приставкой LSM510 META (Carl Zeiss, Германия)
• Конфокальная лазерная сканирующая система, производства "НИКОН КОРПОРЕЙШН" (Япония) - микроскоп медико-биологический инвертированный для лабораторных исследований Eclipse с принадлежностями: со штативом Ti-E, с TIRF-осветителем, с конфокальным модулем А1 и конфокальным модулем на основе спиннинг-диск.

Все новости »

ООО «Мелитэк» поставляет лазерные конфокальные микроскопы. Это современное исследовательское оборудование, которое значительно отличается по своим возможностям от обычных световых микроскопов. С его помощью можно получить не только двухмерные, но и трехмерные изображения, получить информацию о профиле поверхности, измерить толщину полупрозрачных покрытий и пр.

Лазерный конфокальный микроскоп находит свое применение в качестве инструментального микроскопа для измерения линейных размеров, углов, радиусов и пр. Благодаря точности измерения такие микроскопы подходят для контроля качества измерительных, металлообрабатывающих и медицинских инструментов, микроэлектронных компонентов и иных деталей, контроль которых подразумевает проведение измерений в плоскостях XY, XZ и YZ, Одной из особенностей микроскопа LEXT OLS5000 является возможность построения моделей и проведения измерений поверхностий с углом наклона до 87.5 0

Лазерный микроскоп дает возможность изучать структуру и топографию поверхности с возможностью определения перепадов высоты до 6 нм у прозрачных и непрозрачных образцов, что обуславливает его широкое применение в материаловедении, криминалистике и микроэлектронике. Благодаря лазерному источнику света с длиной волны 405 нм подсветке, конфокальной оптической схеме, а так же применении. ФЭУ вместо обычных CMOS или CCD детекторов микросоп LEXT OLS5000 обладает очень малой глубиной резкости, что позволяет определять высоту фокальной плоскости и строить высокоточные 3D модели поверхности. Специальное программное обеспечение позволяет проводить измерение профиля, площади и объема полученных моделей. В плоскости разреза модели можно проводить измерение линейных размеров, радиусов окружностей и углов. Изображения и модели сохраняются в специальном формате, который позволяет провести дополнительные измерения при необходимости.

Характерные особенности, нового конфокального микроскопа LEXT OLS5000:

• определение перепада высот 6 нм
• латеральное разрешение 120 нм
• гарантированная точность измерения линейных размеров на изображениях, полученных методом панорамной сшивки;
• высокая скорость сканирования благодаря специальным алгоритмам;
• повышенная контрастность за счет двойной конфокальной схемы
• цветные изображения с разрешением 4К;
• возможность работать с образцами различных размеров и формы
• инновационные алгоритмы подавления шумов при сканировании.

Специальная модель рамы позволяет проводить измерения образцов высотой до 210 мм, а новые объективы, скорректированные для работы с лазером 405 нм с увеличенной рабочей дистанцией, позволяют исследовать поверхности в углублениях до 25 ммОписания и технические характеристики микроскопов для измерения линейных размеров, представленных в каталоге ООО «Мелитэк», вы найдете на нашем сайте. Если у вас есть вопросы, на них готовы ответить наши сотрудники.

В конфокальном микроскопе, благодаря пинхолу, проводится детекция флуоресценции в одном участке объекта, находящемся в фокусе, с минимальным влиянием флуоресценции окружающих участков за счет перестройки оптической системы в каждый момент времени . Такой способ позволяет значительно повысить разрешающую способность микроскопа по всем трём осям, и избежать засвечивания от подлежащих слоёв образца и слоёв лежащих над плоскостью наблюдения. В качестве источника света используется лазер. За объективной линзой находится небольшая диафрагма. Это нужно чтобы испускаемый свет, проходил через нее и регистрировался, а свет других точек, задерживался диафрагмой и лазер освещает не все поле зрения. В результате визуализация проводится в рамках одного оптического среза. В ходе работы проводится съёмка серии оптических срезов образца или перестройки, на основании чего можно получить его трёхмерную реконструкцию . Однако необходимость сканирования множества участков замедляет процесс работы, и конфокальный микроскоп может получить всего несколько изображений в секунду . Ещё одним фактором, замедляющим работу конфокальных микроскопов, является переход от одного оптического среза к следующему. Сканирующие конфокальные микроскопы, как правило, основаны на следующем принципе: образец фиксируется на определённом уровне, изображение считывается под контролем гальванометрического сканера, затем образец перемещается по вертикальной оси и процедура повторяется . Ускорить процесс сканирования можно сократив затраты времени на каждую точку, однако это снижает чувствительность метода и соотношение сигнал/шум. Скорректировать падение чувствительности можно было бы путём повышения интенсивности освещения, но в этом случае возможно повреждение образца светом и его обесцвечивание .

В системе конфокальной микроскопии единичный пинхол системы заменяется множеством пинхолов, обеспечивающих освещение и получение изображений многих точек образца единовременно. Эти пинхолы расположены на вращающемся по спирали, обеспечивая, в итоге, равномерное освещение образца . Чтобы между отверстиями не происходило засвечивания, они должны находиться на расстоянии, равном десяти их диаметрам, друг от друга . С помощью подобных систем можно получить изображение препарата гораздо быстрее - за одну секунду конфокальные микроскопы на основе системы позволяют получать десятки и сотни изображений.

Конфокальная микроскопия сочетает возможность наблюдения тонких оптических срезов, с высокой чувствительностью флуоресцентной микроскопии. Метод хорошо подходит для исследований динамики цитоскелета, движения везикул и органелл, и других задач, связанных с прижизненным наблюдением клеток. Он является более щадящим по отношению к живым клеткам благодаря тому, что продолжительность освещения каждого участка образца значительно сокращается по сравнению обычным конфокальным микроскопом. Систему можно собрать как на прямом, так и на инвертированном микроскопе, но, всё же, предпочтительно использовать инвертированный , поскольку такой дизайн микроскопа позволяет исследовать живые объекты и культуры клеток.

Для съёмки изображений, получаемых путём микроскопии, может использоваться конфокальный микроскоп c камерой ПЗС, а не детекторы на основе фотоумножителей. Детекция с использованием фотоумножителя позволяет значительно усилить сигнал, но создаёт дополнительные шумы. Охлаждаемые ПЗС-камеры микроскопа, напротив, позволяют получать прижизненные изображения крупного формата, с меньшим количеством шумов .

Двойная система был предложен компанией Yokogawa Electric Corporation. Вторая фокусирующая система при этом расположена так, чтобы встроенные в него линзы располагались перед отверстиями на первом, он осуществляет фокусирование света. Сейчас это наиболее распространённые системы для сборки конфокальных микроскопов. Размер используемых в них пинхолов фиксирован, он оптимален 100× увеличения. Пинхолы систем Yokogawa имеют диаметр 50 мкм, через каждый из них может быть получено изображение фрагмента оптического среза диаметром 500 нм. Синхронизация скорости и длительности съёмки определяет качество изображения .

При использовании эффекта полного внутреннего отражения (TIRF) конфокального микроскопа можно получить сведения о процессах, происходящих в тонком поверхностном слое образца, например, непосредственно под мембраной. Для этого используется рассеяние небольшого количества света в виде затухающей волны при полном внутреннем отражении лазерного луча на границе раздела сред. Система, работающая на данном принципе, может быть объединена с системой в составе одного конфокального микроскопа. Для переключения между режимами необходима турель, удаляющая фильтры при микроскопии с использованием системы переключения между камерами. Методики активного освещения - фотообесцвечивание, фотоактивация и фотоконверсия флуорохромов, предназначены для исследования динамических процессов в клетке. Они могут быть реализованы на микроскопе, оснащённом данной системой лазерной сканирующей микроскопии, с использованием отдельных источников света. В сканирующих конфокальных системах фотообесцвечивание проводится с помощью того же лазера, что и получение изображения за счёт изменения его интенсивности, в результате одновременно проводить эти процедуры нельзя, что затрудняет исследование молекул с высокой подвижностью . Для качественной обработки полученных изображений требуются большие вычислительные мощности компьютера. Производители медицинского оборудования выпускают новейшие образцы данного вида оборудования, которые разделяют лазерный луч возбуждения и люминесценцию. Оборудование получило широкое применение в области биофизики, медицины, молекулярной и клеточной биологии.

Таким образом, спиннинг диск конфокальная микроскопия - представляет собой экономичный и точный способ исследования биологического материала с высоким разрешением, во многом заменяющий конфокальную микроскопию, прежде всего при решении задач, связанных с наблюдениями за живыми объектами. Развитие метода и разработки компании Andor позволили создать конфокальные системы, позволяющие работать без использования лазерных источников света, что снизило стоимость оборудования для исследований подобного класса.

1. Wilson T. Spinning-disk microscopy systems / Cold Spring Harb Protoc. 2010. - 2010. - V.11.
2. Thorn K. Spinning-disk confocal microscopy of yeast / Methods Enzymol.- 2010. V. 470.- P.581-602.
3. Winter PW, Shroff H. Faster fluorescence microscopy: advances in high speed biological imaging / Curr Opin Chem Biol. - 2014. - V.20. - P. 46-53.
4. Stehbens S, Pemble H, Murrow L et al. Imaging intracellular protein dynamics by spinning disk confocal microscopy. Methods Enzymol. - 2012. - V.504. - P.293-313.

Конфокальный микроскоп Nikon. Изображение дендритной клетки, выделенной из костного мозга, экспрессирующей химерный белок MHC II -GFP (5 мкм). Vyas JM . Insights into dendritic cell function using advanced imaging modalities / Virulence. - 2012. - V.3, N.7. - P. 690-694. Конфокальная микроскопия

Прижизненное изображение распределения нейтрофилов в эмбрионе D. rerio. A,B - конфокальная микроскопия, C, D. Lam PY1, Fischer RS, Shin WD, Waterman CM, Huttenlocher A. Spinning disk confocal imaging of neutrophil migration in zebrafish / Methods Mol Biol. - 2014. - V.1124. - P.219-33.

Обычные классические микроскопы не всегда эффективны при проведении сложных исследований. Если для наблюдения крупных объектов их качеств бывает достаточно, то для исследования клеток они дают искажения. Конфокальные приборы лишены многих недостатков обычного микроскопа. В них есть важный элемент - диафрагма, - который отсекает поток фонового рассеянного света.

Каждую единицу времени регистрируется изображение только от одной точки объекта. Это реализуется за счет диафрагмы микроскопа, расположенной за линзой объектива. Она пропускает свет от одной точки, а свет от других точек задерживается. В следующий момент времени оптическая конфокальная система перестраивается (либо перемещается образец), и в диафрагму попадает свет от другой точки. Затем эти точки складываются в единую картину.

Лазером освещается не весь образец, а только определенная его точка, свет от которой и попадает в диафрагму. Соседние области становятся вторичными источниками света, однако диафрагма их отсекает. Регулируя диаметр диафрагмы, наблюдатель может точно устанавливать толщину оптического слоя у фокуса лазерного луча. Тем самым обеспечивается более качественное изображение по оси Z, что является проблемой для многих обычных микроскопов.

Управляет оптической системой компьютер. Наблюдателю не нужно смотреть в окуляр: изображение обрабатывается программой и выводится на экран монитора. Очень важно правильно установливать микроскопы, так как они чувствительны к вибрациям. Для удобства работы и передачи информации, компьютер микроскопа оснащается USB-портами и возможностью подключения к локальной сети и Интернет. Жесткий диск должен быть вместительным, чтобы хранить большое количество информации.

Конфокальная микроскопия – это один из методов оптической микроскопии, который обладает существенным контрастом по сравнению с обычными классическими микроскопами. Отличительной особенностью данного метода является использование диафрагмы, способной отсекать поток фонового рассеянного света.

В конфокальном микроскопе в каждый момент времени происходит регистрация изображения одной токи объекта. Полноценное изображение получается за счет сканирования передвижения образца или перестройки оптической системы. После объективной линзы расположена диафрагма небольшого размера так, чтобы свет, испускаемый исследуемой точкой, проходил через нее и регистрировался, а свет, исходящий от других точек, задерживался диафрагмой.

Описанный метод исследования позволяет изучать внутреннюю структуру различных клеток. С его помощью можно идентифицировать отдельные молекулы и структуры клетки, микроорганизмы, а также динамические процессы, протекающие в клетках.

Описание метода конфокальной микроскопии

Благодаря конфокальной флуоресцентной микроскопии появилась возможность получать трехмерное субмикронное расширение объектов, а также значительно расширилась возможность проведения неразрушающего анализа прозрачных образцов. Благодаря использованию в указанных микроскопах в качестве источников света лазеров, достигается повышение их разрешающей способности.

По сравнению с ксеновыми или ртутными лампами лазеры отличаются существенными преимуществами, так как обладают способностью монохроматичности, а также высокой параллельности испускаемого пучка света. Такие свойства лазерного излучения обеспечивают оптической системе более эффективную работу, а также снижают количество бликов и увеличивают точность фокусировки пучка света.

На исследуемом образце лазер освещает не все поле зрения, а фокусируется в определенной точке. Конфокальная диафрагма позволяет избавиться от внефокусной флуоресценции, при этом изменяя диаметр диафрагмы, можно точно определять толщину оптического слоя возле фокуса лазерного луча. Благодаря описанному свойству конфокальная микроскопия позволяет получать улучшенное разрешение вдоль оси Z.

Специальные программы, которыми оснащены конфокальные микроскопы, позволяют из серии оптических срезов создавать объемные изображения объектов, а также рассматривать их под разными углами зрения.

Применение мультиспектрального лазерного сканирующего конфокального микроскопа дает возможность изучать колоколизацию в клетке различных веществ. Мультиспектральный режим позволяет проводить на конфокальном микроскопе исследования по методу FISH.

Примеры исследований, проводимых с помощью конфокального микроскопа

Конфокальная микроскопия помогает изучать способность различных веществ накапливаться в ядре, цитоплазме или в других клеточных структурах. Эти способности зачастую применяются в процессе проведения исследований механизмов действия канцерогенов, противоопухолевых соединений, лекарственных препаратов, а также позволяют рассчитывать их эффективные концентрации.

Летальное изучение интенсивности, а также формы спектров собственной флуоресценции дает возможность распознавать воспаленные и нормальные клетки. Этот метод используется на ранних сроках диагностики рака шейки матки.

Правильно подобранная комбинация различных фильтров, предназначенных для нескольких типов собственной флуоресценции, может получаться без трудоемкого исследования множества срезов. Таким образом, можно быстро и точно обнаруживать злокачественные тканевые структуры и отличать их от нормальных.

Методы конфокальной микроскопии достаточно широко используются в гидробиологии и эмбриологии, в ботанике и зоологии в процессе изучения структуры гамет, а также развития и формирования организмов.

Конфокальные лазерные микроскопы в современном мире нашли широкое применение в области биологии, биофизики, медицины, клеточной, а также молекулярной биологии. Конфокальная микроскопия – это уникальная бесконтактная методика, которая сегодня используется для изучения роговицы глаза. Она позволяет максимально точно оценить имеющуюся степень клеточных изменений и внеклеточных структур, а также сделать выводы о возможном повреждении роговицы в целом.

Лазерные конфокальные микроскопы обладают высоким разрешением, поэтому позволяют исследовать структуру флуоресцентно меченых клеток и даже отдельных генов. Применение всевозможных технологий специфической многоцветной флуоресцентной окраски для биологически активных молекул, а также надмолекулярных комплексов дает возможность изучать сложные механизмы функционирования не только отдельных клеток, но и целых систем. Данная технология широко используется в экспериментальной биологии, а также в медицине.

Оборудование - конфокальные микроскопы

Современные сверхточные конфокальные микроскопы, такие как Leica TCS SP8 позволяют получить максимально четкие и достоверные данные при проведении различных исследований. Широкий интерес к таким приборам возник в восьмидесятых годах прошлого столетия, из-за быстрого развития компьютерной техники и лазерных технологий.

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия представляет собой разновидность оптической микроскопии. Ее особенностью является то, что лазерный луч фокусируется на определенную область по осям Х и У и формирует, таким образом, изображение. Отраженный свет демонстрируется на экране в виде растра. Размеры изображения напрямую зависят от разрешающей способности современной электроники, а также от размеров сканируемого растра.

Измерительные приборы, которые созданы с помощью современного метода конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, в наше время получили широчайшее распространение в разных сферах. По сравнению с обычной световой микроскопией конфокальная микроскопия обладает следующими преимуществами:

• улучшенная разрешающая способность;
• высокая контрастность изображения;
• возможность проводить мультиспектральные исследования с высокой степенью разделения сигналов;
• возможность получения «оптических срезов» с трехмерной реконструкцией;
• возможности использования способов цифровой обработки полученных изображений;

Из недостатков описанной аппаратуры можно выделить:

• сложность настройки прибора;
• отсутствие оптического изображения;
• высокая стоимость приборов, также дороговизна их обслуживания.

В конфокальном микроскопе для управления всей системой используется специальный компьютер. Он позволяет сохранять изображения и детально изучать полученные данные. Для качественной обработки полученных изображений зачастую требуются достаточно большие вычислительные мощности, поэтому компьютер должен обладать довольно большой оперативной памятью. Для дальнейшего хранения информации требуется также и большая дисковая память. Для передачи изображений такой компьютер должен иметь USB-порт или CD/DVDRW. Также компьютер имеет возможность подключения к глобальной интернет или локальной сети.

Программное обеспечение, установленное в таких компьютерах, может быть базовым. Оно поставляется вместе с техникой и позволяет управлять всей системой и контролировать ее основные функции. Также для указанных компьютеров специально разрабатываются пакеты прикладных задач, которые заказываются дополнительно. Многие модели конфокальных микроскопов имеют специальный пульт управления, позволяющий настраивать их работу дистанционно.

Устанавливают описанные приборы в обычных лабораторных посещениях. Важнейшей процедурой в процессе эксплуатации конфокальных микроскопов является контроль за вибрациями. Для таких целей применяют специальное устройство, измеряющее уровень вибрации. Процедура контроля похожа на процедуру измерения аксиальной разрешающей способности ЛСКМ при помощи зеркала.

Конфокальная микроскопия стремительно развивается. Известные компании-производители представляют на рынке новейшие образцы конфокальных микроскопов, которые позволяют эффективно разделять лазерный луч возбуждения, а также люминесценцию. С помощью компьютера в таких приборах управляется светоделитель. Его спектральные свойства при необходимости могут достаточно быстро перестраиваться на несколько лазерных линий.

Конфокальные микроскопы в микробиологии

Конфокальный микроскоп также незаменим в биологии для детального исследования клетки. Сегодня на эту тему публикуется огромное количество различных научных статей. Чаще всего при помощи конфокальных микроскопов изучают структуру клеток, а также их органоидов. Также исследуется колокализация в клетке для того, чтобы понять есть ли причинно-следственная связь между веществами клетки.

В процессе изучения белков конфокальными микросокпами они предварительно маркируются антителами с разными флуорохромами. С помощью обычного классического микроскопа довольно трудно разобрать расположены ли они рядом либо же один под другим, а вот конфокальный микроскоп позволяет это сделать без особых проблем. В памяти компьютера записываются данные о серии оптических срезов и, таким образом, проводится объемная реконструкция объекта, атакже получается его трехмерное изображение.

Также с помощью конфокальных микроскопов исследуют динамическое процессы, протекающие в живых клетках, например, передвижение ионов кальция или других веществ сквозь клеточные мембраны. Используют конфокальные микроскопы и для изучения подвижности биоорганических молекул с помощью ионизации фотохимического разложения флуорохрома в зоне облучения, а также последующего его рассоединения с молекулами. Такие молекулы маркируются двумя флуорохромами, обладающими спектром испускания донора, который перекрывается спектром поглощения акцептора. Таким образом, энергия передается от донора к акцептору на небольших расстояниях и в результате резонанса между энергетическими уровнями. После этого акцептор в видимой области спектра излучает энергию, которая впоследствии регистрируется с помощью конфокального микроскопа.

Развитие конфокальной микроскопии продолжается. Компании-производители указанного оборудования ежегодно представляют на рынке все более современные, функциональные и усовершенствованные микроскопы, позволяющие ученым совершать новые полезные открытия в самых разных сферах. Совершенствуется и программное обеспечение, предназначенное для компьютеров, которыми оснащены конфокальные микроскопы. Оно позволяет воплощать в жизнь самые сложные задачи, которые дают возможность проводить исследования на молекулярном и клеточном уровне. Сегодня с уверенностью можно сказать, что за конфокальными микроскопами будущее, так как по своим функциональным характеристикам и техническим возможностям они существенно превзошли обычные микроскопы. Среди достаточно широкого ассортимента конфокальной оптической аппаратуры каждый пользователь сможет подобрать для себя именно торт микроскоп, который позволит ему активно развивать свои исследования.

История

В 50-х годах биологам понадобилось увеличить контраст наблюдения меченых флюорохромами объектов в толстых срезах тканей . Для разрешения этой проблемы Марвин Минский , профессор в США, предложил использовать для флуоресцентных микроскопов конфокальную схему. В 1961 г. Минский получил на эту схему патент .

Принцип работы

Конфокальный микроскоп имеет разрешение такое же как и обычный микроскоп и ограничено оно дифракционным пределом .

где длина волны излучения, - числовая апертура объектива, - показатель преломления среды между образцом и объективом, - половина угла, который «захватывает» объектив. В видимом диапазоне разрешение составляет ~ 250 нм (NA=1,45, n=1,51) Однако, в последние годы успешно развиваются схемы микроскопов, которые используют нелинейные свойства флуоресценции образцов. В этом случае достигается разрешение значительно меньшее дифракционного предела и составляет ~ 3-10 нм .

Конфокальный микроскоп создаёт чёткое изображение образца, которое при использовании обычного микроскопа представляется размытым. Это достигается путем отрезания апертурой фонового света идущего из глубины образца, то есть того света, который не попадает на фокальную плоскость объектива микроскопа. В результате изображение получается с контрастом лучшим, чем в обычном оптическом микроскопе.

Изображение представляет собой двумерную (2D) картину.

См. также

Преимущества в биологии перед другими микроскопами

Показатель преломления биологических объектов почти такой же как у стекла, поэтому наблюдение этих объектов, находящийся на поверхности предметного стекла, в обычном микроскопе весьма затруднено. Конфокальный микроскоп, имеющий высокий контраст, даёт две неоценимые возможности: он позволяет исследовать ткани на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности, а также оценивать результаты исследования (то есть клеточной активности) в четырёх измерениях - высота, ширина, глубина и время.

Примечания

Ссылки

• Molecular Expressions : Laser Scanning Confocal Microscopy
• Nikon’s MicroscopyU . Comprehensive introduction to confocal microscopy.
• Emory’s Physics Department . Introduction to confocal microscopy and fluorescence.
• The Science Creative Quarterly’s overview of confocal microscopy - high res images also available.
• Programmable Array Microscope - Confocal Microscope Capabilities.

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Конфокальный микроскоп" в других словарях:

У этого термина существуют и другие значения, см. Микроскоп (значения). Микроскоп, 1876 год … Википедия

Атомно силовой микроскоп Атомно силовой микроскоп (АСМ, англ. AFM atomic force microscope) сканирующий зондовый микроскоп высокого разрешения. Используется для определения рельефа поверхности с разрешением от дес … Википедия

Общее название методов наблюдения в микроскоп неразличимых человеческим глазом объектов. Подробнее см. в ст. (см. МИКРОСКОП). Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. Главный редактор А. М. Прохоров. 1983 … Физическая энциклопедия

- (англ. nitrogen vacancy center) или азото замещённая вакансия в алмазе это один из многочисленных точечных дефектов алмаза. Дефект представляет собой нарушение строения кристаллической решётки алмаза, возникающий при удалении атома… … Википедия

В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Мински. В Википедии есть статьи о других людях с такой фамилией, см. Минский. Марвин Ли Мински англ. Marvin Lee Minsky … Википедия

Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

Мински, Марвин Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

Ли Американский учёный в области искусственного интеллекта Дата рождения: 9 августа 1927(19270809) … Википедия

Книги

• Конфокальная микроскопия и ультрамикроскопия живой клетки , Свищев Георгий Михайлович. Конфокальный микроскоп - это разновидность сканирующего светового микроскопа. При исследовании толстых объектов он дает изображения, свободные от фона, которые вобычных микроскопах создается…