Главная » Безопасность » Репродукцию вирусов в клеточных системах. Фазы репродукции вируса

Репродукцию вирусов в клеточных системах. Фазы репродукции вируса

Вирусы воспроизводят себе подобные частицы в таком огромном количестве и столь своеобразным способом, что это явление стали именовать репродукцией, так как здесь копируются молекулы нуклеиновых кислот и, согласно заключенной в них генетической информации, синтезируются вирусные белки.

При большом разнообразии механизмов репродукции вирусов общим для всех видов является:

источником мономеров для синтеза нуклеиновых кислот служат нуклеотиды клетки;
источником мономеров для синтеза вирусных белков служат аминокислоты (аминоацил тРНК) клетки;
синтез белков всех вирусов осуществляется на клеточных рибосомах;
источник энергии для биосинтетических процессов при репродукции всех вирусов - аденазинтрифосфорная кислота (АТФ), вырабатываемая в митохондриях клетки;
дисъюнктивный (разобщенный во времени и в пространстве) биосинтез структурных компонентов вирусов. Так, нуклеиновая кислота вируса может реплицироваться, например, в ядре клетки, вирусный белок синтезируется в цитоплазме, а сборка цельных вирионов или нуклеокапсидов может происходить на внутренней поверхности цитоплазматической мембраны. Наконец, сложный липопротеиновый суперкапсид может приобретаться вирусами в процессе почкования;
репликацию нуклеиновых кислот вирусов осуществляют ферменты - полимеразы (ДНК-полимеразы и РНК-синтетазы), которые могут быть клеточными полимеразами, присутствующими в клетке до ее заражения вирусом, либо вирусспецифическими, появляющимися после заражения клетки вирусом, так как биосинтез их закодирован в структуре нуклеиновых кислот самих вирусов или они находятся в вирионе вируса;
точность копирования молекул нуклеиновых кислот при их репликации обеспечивается матричным механизмом и принципом комплементарности.

Взаимодействие вируса с клеткой хозяина - сложный и многостадийный процесс. В результате такого взаимодействия могут развиваться три основные формы клеточной инфекции: продуктивная, абортивная и интегративная.

Продуктивная форма чаще носит литический характер, т. е. заканчивается гибелью и лизисом инфицированной клетки, что происходит после полной сборки дочерней популяции инфицированных вирусных частиц. Гибель клетки могут вызвать следующие факторы: раннее подавление синтеза клеточных белков, накопление повреждающих клетку вирусных компонентов; повреждение лизосом и высвобождение их ферментов в цитоплазму. Такая форма инфекции наблюдается у многих вирусов.

Абортивная форма не завершается образованием инфекционных вирусных частиц или они образуются в гораздо меньшем количестве, чем при продуктивной инфекции. Абортивная инфекция может возникать при следующих обстоятельствах: заражение чувствительных клеток дефектным вирусом, заражение чувствительных клеток в неразрешающих условиях, т. е. при резком изменении условий, при которых происходит инфекционный процесс, заражение нечувствительных клеток стандартным вирусом. В результате клетка либо погибает без продукции инфекционного вируса, либо инфекция прерывается на определенном этапе.

Дефектным называется такой вирус, который не способен проявить все генетические функции, необходимые для образования инфекционного потомства. Существуют дефектные вирусы и дефектные вирусные частицы. Дефектными называют такие вирусы, которые репродуцируются лишь в присутствии вируса-помощника, например аденоассоциированный вирус (семейство парвовирусов), дающий потомство только в присутствии аденовируса - помощника. Дефектные вирусные частицы лишены части генетического материала (от 10 до 90 % генома). Дефектные частицы интерферируют при репродукции с инфекционными вирусными частицами и поэтому их называют дефектными интерферирующими частицами (ДИЧ). Попадая в клетку вместе с инфекционными вирусными частицами, они конкурируют с ними за факторы репродукции и препятствуют образованию инфекционного потомства. Большое количество ДИЧ проявляется при серийном пассивировании вируса с высокой множественностью заражения.

Интегративная форма не приводит к гибели клетки. Нуклеиновая кислота вируса, встроенная в геном клетки-хозяина, функционирует как составная часть клеточного генома. Клетка может сохранить нормальные функции и при ее делении вирусные последовательности могут переходить в геном дочерних клеток. Интеграция может привести к неопластической трансформации клеток. Такие клетки приобретают способность к неограниченному делению.

Интегративная форма инфекции возможна для нескольких семейств: ретровирусов, аденовирусов, вирусов герпеса, паповавирусов и др.

I. Адсорбция вируса на клетках.

II. Проникновение в клетки.

III. Раздевание вируса в клетке.

Эти стадии направлены на то, чтобы вирус был доставлен в соответствующие клеточные структуры и его внутренний компонент был освобожден от защитных оболочек. Как только эта цель достигнута, начинается вторая фаза репродукции, в течение которой происходит экспрессия вирусного генома. Эта фаза включает в себя пять стадий:

I. Транскрипция.

II. Трансляция иРНК.

III. Репликация генома.

IV. Сборка вирусных компонентов.

V. Выход вируса из клетки.

Первая фаза репродукции . I. Адсорбция вирионов на поверхности клетки . Прикрепление вирусных частиц к поверхности клетки-хозяина - первая стадия инфекционного процесса. Начальный контакт вируса с клеткой происходит в результате случайного столкновения по типу броуновского движения.

В основе адсорбции лежат два механизма.

Первый из них - неспецифический. Определяется силами электростатического взаимодействия, возникающими между разнозаряженными группами, расположенными на поверхности клетки и вируса. В этом процессе участвуют заряженные положительно аминные группы вирусного белка и кислые фосфатные, сульфатные и карбоксильные группы клеточной поверхности, имеющие отрицательный заряд.

Второй - специфический. Специфичность связи между вирусом и клеткой обусловлена комплементарными клеточными и вирусными рецепторами.

Процесс адсорбции возможен при наличии соответствующих рецепторов на поверхности клетки и «узнающих» их субстанций на поверхности вируса. Узнавание клеточных рецепторов вирусными белками (рецепторами), ведущее к прикреплению вирусной частицы к клетке, является высокоспецифическим процессом. Белки на поверхности вируса, узнающие специфические группировки на плазматической мембране клетки и обусловливающие прикрепление к ним вирусной частицы, называются прикрепительными белками (рецепторами). Рецепторы могут иметь разную химическую природу и представлять собой белки, углеводный компонент белков и липидов. Рецепторами для вирусов гриппа и парамиксовирусов является сиаловая кислота в составе гликопротеидов и гликолипидов, для рабдо — и реовирусов - также углеводный компонент в составе белков и липидов, для пикорна — и аденовирусов - белки, для некоторых вирусов - липиды. Специфические клеточные рецепторы играют роль не только в прикреплении вирусной частицы к клеточной поверхности. Они определяют дальнейшую судьбу вирусной частицы, ее внутриклеточный транспорт и доставку в определенные участки цитоплазмы и ядра, где вирус способен инициировать инфекционный процесс. Вирус может прикрепиться и к неспецифическим рецепторам и даже проникнуть в клетку, однако только прикрепление к специфическому рецептору приведет к возникновению инфекции.

Количество специфических рецепторов на поверхности клетки колеблется между 10 4 и КР на одну клетку. Рецепторы ряда вирусов могут быть представлены лишь в ограниченном наборе клеток-хозяев, и этим может определяться чувствительность организма к данному вирусу. Например, вирусы полиомиелита адсорбируются только на клетках приматов. Рецепторы для других вирусов, напротив, широко представлены на поверхности клеток различных видов, как, например, рецепторы для ортомиксо — и ларамиксовирусов, представляющие собой сиалилсодержащие соединения, имеют относительно широкий диапазон клеток, на которых может происходить адсорбция вирусных частиц. Рецепторами для ряда тогавирусов обладают клетки широкого круга хозяев: эти вирусы могут адсорбироваться и инфицировать клетки как позвоночных, так и беспозвоночных. Вирусные ДНК и РНК обладают способностью заражать более широкий круг хозяев, чем вирусы. Максимальная скорость адсорбции вируса наблюдается лишь при определенном соотношении концентрации вируса и клеток, влиянии pH, температуры, ионного состава среды.

Адсорбция вируса на клетках происходит в широком диапазоне температур. Она протекает нормально в присутствии катионов и подавляется веществами, несущими высокий отрицательный заряд (сульфатированные полисахариды, гепарин). Для ряда оболочечных вирусов известна обратная закономерность.

Процесс адсорбции состоит из двух быстро следующих друг за другом периодов: обратимого и необратимого. Период обратимого прикрепления может закончиться десорбцией. При длительном контакте вируса с клеткой никакие воздействия не позволяют освободить адсорбированный вирус, наступает стадия необратимой адсорбции. Вирус ящура, например, адсорбируется клетками культуры почки свиней при 2-4 и 37 °С, однако при низкой температуре адсорбция вируса обратима и инфицирования клеток не происходит, так как вирус находится на поверхности клеток и легко может быть десорбирован раствором версена без нарушения целостности клеток, тогда как при 37 °С через 80-90 мин наступала полная необратимая адсорбция вируса. Количество адсорбированного вируса и число инфицированных клеток в основном зависят от множественности заражения и продолжительности адсорбции.

Адсорбированные вирусные частицы могут иметь различную судьбу: большая часть их элюируется, при этом они повреждаются, так как теряют способность к реадсорбции другими клетками и не инфицируют их; другая часть вирусных частиц проникает в клетку и подвергается дезинтеграции; небольшая часть инфекционных вирусных частиц, связанных с клеткой, остается интактной.

Прикрепительные белки могут находиться в составе уникальных органелл, таких, как структуры отростка у Т-бактериофагов или фибры у аденовирусов, которые хорошо видны в электронном микроскопе; могут формировать морфологически менее выраженные, но не менее уникальные структуры белковых субъединиц на поверхности вирусных мембран, как, например, шипы у оболочечных вирусов, «корону» у коронавирусов.

Просто организованные вирусы животных содержат прикрепительные белки в составе капсида. У сложно организованных вирусов эти белки входят в состав суперкапсида и представлены множественными молекулами. Например, у вируса леса Семлики (α-вирус) имеется 240 молекул гликопротеида в одном вирионе, у вируса гриппа - 300-450 гемагглютинирующих субъединиц, у аденовируса - 12 фибров.

Спектр чувствительности клеток к вирусам в значительной степени определяется наличием соответствующих рецепторов. Прикрепление вируса к клетке - непременное, но недостаточное условие для инфицирования, которое определяется прохождением последующих стадий репродукции вируса.

II. Проникновение вируса в клетку . В настоящее время известно два механизма проникновения вируса в клетку: путем рецепторного эндоцитоза и путем слияния вирусной и клеточной мембран. Оба эти механизма не исключают, а дополняют друг друга.

Рецепторный эндоцитоз происходит в специализированных участках плазматической мембраны, где имеются специальные ямки, на дне которых находятся специальные рецепторы. Ямки обеспечивают быструю инвагинацию и образование внутриклеточных вакуолей (за 1 мин образуется более 2 тыс. вакуолей), которые сливаются с цитоплазматическими вакуолями, образуя рецептосомы, а они могут сливаться с лизосомами. Эндоцитоз обеспечивает внутриклеточный транспорт вириона в составе вакуоли, освобождая вирусную частицу в соответствующих внутриклеточных участках. Так, например, ядерные вирусы попадают в ядро, а реовирусы - в лизосомы. Большинство вирусов животных проникает в клетку путем эндоцитоза.

Слияние вирусных и клеточных мембран . У оболочечных вирусов слияние обусловлено точечным взаимодействием вирусного белка путем слияния с липидами клеточной мембраны, в результате вирусная липопротеидная оболочка интегрирует с клеточной мембраной.

У безоболочечных вирусов один из поверхностных белков также взаимодействует с липидами клеточных мембран, в результате внутренний компонент проходит через мембрану и вовнутрь клетки проникает только нуклеопротеид вириона. При данном способе проникновения функционально активный вирусный нуклеопротеид освобождается из вириона в период его прохождения внутрь клетки через плазматическую мембрану, т. е. одновременно происходит проникновение и «раздевание» вириона. Белком слияния у вирусов является один из поверхностных белков, так, у парамиксовирусов это белок (F-белок), у вируса гриппа функцию белка слияния выполняет малая гемагглютинирующая субъединица (НА2).

Большинство вирусов вызывает слияние мембран при низком значении pH - от 5,0 до 5,75.

III. Раздевание - депротеинизация вируса . Проникшие в клетку вирусные частицы должны раздеться для того, чтобы вызвать инфекционный процесс. Смысл раздевания заключается в удалении вирусных защитных оболочек, которые препятствуют экспрессии вирусного генома. В результате раздевания освобождается внутренний компонент вируса, который способен вызвать инфекционный процесс. Раздевание сопровождается рядом характерных особенностей: в результате распада вирусной частицы исчезает инфекционная активность, в ряде случаев появляется чувствительность к нуклеазам, возникает устойчивость к нейтрализующему действию антител, теряется фоточувствительность при использовании ряда препаратов.

Конечными продуктами раздевания являются сердцевины, нуклеокапсиды или нуклеиновые кислоты. Для ряда вирусов было показано, что продуктом раздевания являются не голые нуклеиновые кислоты, а связанные с внутренним вирусным белком. Например, конечный продукт раздевания пикорнавирусов - РНК, ковалентно связанная с белком VPg, конечный продукт раздевания аденовирусов, вируса полиномы и SV40 - ДНК, ковалентно связанная с одним из внутренних вирусных белков.

В ряде случаев способность вирусов вызвать инфекционный процесс определяется возможностью их раздевания в клетке данной системы. Тем самым эта стадия является одной из ограничивающих инфекцию.

Раздевание ряда вирусов происходит в специализированных участках внутри клетки (лизосомах, структурах аппарата Гольджи, околоядерном пространстве, ядерных порах на ядерной мембране). При слиянии вирусной и клеточной мембран проникновение в клетку сочетается с раздеванием.

Раздевание и внутриклеточный транспорт - взаимосвязанные процессы: при нарушении правильного внутриклеточного транспорта к местам раздевания вирусная частица попадает в лизосому и разрушается лизосомальными ферментами.

Раздевание вирусной частицы осуществляется постепенно в результате серии последовательных реакций. Например, в процессе раздевания пикорнавирусы проходят ряд стадий с образованием промежуточных субвирусных частиц с размерами от 156S до 12S. Раздевание аденовирусов происходит в цитоплазме и ядерных порах и имеет по крайней мере три стадии: 1) образование субвирусных частиц с большей плотностью, чем вирионы; 2) образование сердцевин, в которых отсутствует 3 вирусных белка; 3) образование ДНК-белкового комплекса с терминальным белком.

Вирусы оспы раздеваются в две стадии: на первой - ферменты хозяина удаляют наружное покрытие, а на второй - для освобождения вирусной ДНК из сердцевины требуется участие продуктов вирусных генов («раздевающий фермент»), синтезированных после заражения.

Вторая фаза репродукции . I. Транскрипция . Это переписывание информации с ДНК на РНК по законам генетического кода. Осуществляется с помощью специального фермента (РНК-полимеразы), который связывает нуклеотиды путем образования 3’-5′-фосфодиэфирных мостиков. При инициации транскрипции РНК-полимераза связывается со специальным участком ДНК (промотором), удвоенные спирали ДНК разъединяются и функционируют как матрицы, к которым присоединяются комплементарные нуклеотиды благодаря спариванию комплементарных оснований (аденин с тимином, урацил с аденином, гуанин с цитазином и цитазин с гуанином). Таким образом, происходит постепенное удлинение (элонгация) цепи НИК. Терминация (прекращение роста) цепи ГПК происходит на специфических участках ДНК, называемых терминаторами. При этом процессе принимают участие и специальные белки.

Стратегия вирусного генома в отношении синтеза иРНК у разных вирусов различна. У ДНК-содержащих вирусов иРНК синтезируется на матрице одной из нитей ДНК. Формула переноса генетической информации у них такая же, как и в клетке:

ДНК →(транскрипция)→ РНК →(трансляция)→ белок.

ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происходит в ядре, используют для транскрипции клеточную полимеразу. К этим вирусам относятся папова-, аденовирусы, вирусы герпеса. ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происходит в цитоплазме, не могут использовать клеточные ферменты, находящиеся в ядре. Транскрипция их генома осуществляется вирусспецифическим ферментом - ДНК-полимеразой, которая проникает в клетку в составе вириона. К этим вирусам относятся вирусы оспы и иридовирусы.

РНК → белок.

К этой группе вирусов относятся пикорна-, тога-, коронавирусы. У них нет необходимости в акте транскрипции для синтеза вирусспецифических белков. Поэтому транскрипцию как самостоятельный процесс у этих вирусов не выделяют.

Б. У вирусов, геном которых не может выполнять функцию иРНК (минус-нитевые вирусы). В клетке синтезируется комплементарная геному РНК, которая и является информационной. Передача генетической информации у этих вирусов осуществляется по формуле:

РНК → РНК → белок.

У этих вирусов транскрипция выделена как самостоятельный процесс в инфекционном цикле. К ним относятся две группы вирусов животных:

вирусы, геном которых представлен односпиральной РНК: ортомиксо-, парамиксо-, рабдо-, буньявирусы;
вирусы, геном которых представлен двуспиральной РНК. Среди вирусов животных к ним относятся реовирусы.

В клетке нет фермента, который может полимеризовать нуклеотиды на матрице РНК. Эту функцию выполняет вирусспецифический фермент - РНК-зависимая PHK-полимераза, или транскриптаза, которая находится в составе вирионов и вместе с ними проникает в клетку.

В. Среди РНК-содержащих вирусов животных есть семейство ретровирусов, которые имеют уникальный путь передачи генетической информации. РНК этих вирусов переписывается на ДНК, ДНК интегрирует с клеточным геномом и в его составе переписывается на РНК, которая обладает информационными функциями. Путь передачи генетической информации в этом случае осуществляется по более сложной формуле: РНК → ДНК → PHК → белок

В составе этих вирусов есть уникальный вирусспецифический фермент, который переписывает РНК на кДНК. Этот процесс называется обратной транскрипцией, а фермент - обратная транскриптаза, или ревертаза. Тот же фермент синтезирует нить ДНК на матрице ДНК. Двуспиральная ДНК после замыкания в кольцо интегрирует с клеточным геномом, и транскрипцию интегрированной ДНК в составе клеточных геномов осуществляет клеточная ДНК-зависимая РНК-полимераза.

Транскрипция вирусного генома строго регулируется на протяжении инфекционного цикла. Регуляция осуществляется как клеточными, так и вирусспецифическими механизмами. У некоторых вирусов, в основном ДНК-содержащих, существует три периода транскрипции: сверхранний, ранний и поздний. К ним относятся вирусы оспы, герпеса, папова-, адено — и иридовирусы. В результате сверхранней и ранней транскрипции избирательно считываются сверхранние и ранние гены с образованием сверхранних или ранних иРНК. При поздней транскрипции считывается другая часть вирусного генома - поздние гены с образованием поздних и PHК. Количество поздних генов обычно превышает количество ранних генов. Многие сверхранние гены являются генами для неструктурных белков (ферментов и регуляторов транскрипции) и репликации вирусного генома. Напротив, поздние гены обычно являются генами для структурных белков. Обычно при поздней транскрипции считывается весь геном, но с преобладанием транскрипции поздних генов.

Фактором регуляции транскрипции у ядерных вирусов является транспорт транскриптов из ядра в цитоплазму, к месту функционирования иРНК - полисомам.

Продуктом сверхранней транскрипции вирусов герпеса являются α-белки. Функция одного или нескольких из них необходима для транскрипции следующей группы генов, кодирующих β-белки. В свою очередь, β-белки включают транскрипцию последней группы поздних генов, кодирующих γ-белки. Такой тип регуляции получил название «каскадный».

II. Трансляция . Эго - процесс перевода генетической информации, содержащейся в иРНК на специфическую последовательность аминокислот в синтезируемых вирусспецифических белках. Синтез белка в клетке происходит в результате трансляции иРНК на рибосомах. В рибосомах идет слияние потока информации (в иРНК) с потоком аминокислот, которые приносят транспортные РНК (тРНК). В клетке существует большое количество разнообразных тРНК. Для каждой аминокислоты должна быть своя тРНК.

Молекула тРНК представляет собой односпиральную РНК со сложной структурой в виде кленового листа.

Связывание конкретной тРНК и аминокислоты осуществляет фермент аминоацилсинтетаза. Один конец тРНК связывается с аминокислотой, а другой - с нуклеотидами иРНК, которым они комплементарны. Три нуклеотида на иРНК кодируют одну аминокислоту и называются «триплет» или «кодон», а комплементарные кодону три нуклеотида на тРНК называются «антикодоном».

Процесс транскрипции состоит из трех фаз: инициации элонгации, терминации.

Инициация трансляции - наиболее ответственный этап в процессе трансляции, основанный на узнавании рибосомой иРНК и связывании с ее особыми участками. Рибосома узнает иРНК благодаря «шапочке» (кэп) на 5′-конце и скользит к 3′-концу, пока не достигнет инициаторного кодона, с которого начинается трансляция. В эукариотической клетке инициаторными кодонами являются кодоны АУГ (аденин, урацил, гуанин), кодирующие метионин. С метионина начинается синтез всех полипептидных цепей. Специфическое узнавание рибосомой вирусной и РНК осуществляется за счет вирусспецифических инициаторных факторов.

Вначале с иРНК связывается малая рибосомальная субъединица. К комплексу иРНК с малой рибосомальной субъединицей присоединяются другие компоненты, необходимые для начала трансляции. Это - несколько молекул белка, которые называются «инициаторные факторы». Их, по крайней мере, три в прокариотической клетке и более девяти в эукариотической клетке. Инициаторные факторы определяют узнавание рибосомой специфических иРНК. В результате формируется комплекс, необходимый для инициации трансляции, который называется «инициаторным комплексом». В инициаторный комплекс входят: иРНК; малая рибосомальная субъединица; аминоацил-тРНК, несущая инициаторную аминокислоту; инициаторные факторы; несколько молекул ГТФ (гуанозинтрифосфат).

В рибосоме осуществляется слияние потока информации с потоком аминокислот. Вхождение аминоацил-тРНК в А-центр большой рибосомальной субъединицы является следствием узнавания, а ее антикодон взаимодействует с кодоном иРНК, находящейся в малой рибосомальной субъединице. При продвижении иРНК на один кодон тРНК перебрасывается в пептидильный центр (П-центр), и ее аминокислота присоединяется к инициаторной аминокислоте с образованием первой пептидной связи. Свободная от аминокислоты тРНК выходит из рибосомы и может опять функционировать в транспорте специфических аминокислот. На ее место из A-центра в П-центр перебрасывается новая тРНК, и образуется новая пептидная связь. В A-центре появляется вакантный кодон иРНК, к которому немедленно присоединяется соответствующая тРНК, и происходит присоединение новых аминокислот к растущей полипептидной цепи.

Элонгация трансляции - процесс удлинения, наращивания полипептидной цепи, основанный на присоединении новых аминокислот с помощью пептидной связи. Происходит постоянное протягивание нити иРНК через рибосому и «декодирование» заложенной в ней генетической информации. Часто иРНК функционирует одновременно на нескольких рибосомах, каждая из которых синтезирует одну и ту же полипептидную нить, кодируемую данной иРНК.

Терминация трансляции происходит в тот момент, когда рибосома доходит до терминирующего кодона в составе иРНК (УАА, УГА, УАГ). Трансляция прекращается, и полипептидная цепь освобождается из полирибосомы. После окончания трансляции полирибосомы распадаются на субъединицы, которые могут войти в состав новых полирибосом.

Каждая и PHК функционирует на нескольких рибосомах. Группу рибосом, работающих на одной молекуле иРНК, называют полирибосомой или полисомой. Полисомы могут состоять от 4-6 до 20 и более рибосом.

Вирусспецифические полисомы могут быть как свободными, так и связанными с мембранами. Внутренние белки обычно синтезируются на свободных полисомах, гликопротеиды всегда синтезируются на полисомах, связанных с мембранами.

Поскольку геном вируса животных представлен молекулой, кодирующей более чем один белок, вирусы поставлены перед необходимостью синтеза либо длинной иРНК, кодирующей один гигантский полипептид-предшественник, который затем должен быть нарезан в специфических точках на функционально активные белки, либо коротких моноцистронных иРНК, каждая из которых кодирует один белок. Таким образом, существуют два способа формирования вирусных белков:

первый - иРНК транслируется в гигантский полипептид-предшественник, который после синтеза последовательно нарезается на зрелые функционально активные белки;

второй - иРНК транслируется с образованием зрелых белков или белков, которые лишь незначительно модифицируются после синтеза.

Первый способ трансляции характерен для РНК-содержащих плюс-нитевых вирусов - пикорнавирусов и тогавирусов. Их иРНК транслируется в гигантскую полипептидную цепь, так называемый полипротеид, который сползает в виде непрерывной ленты с рибосомного «конвейера» и нарезается на индивидуальные белки нужного размера. Нарезание вирусных белков - многоступенчатый процесс, осуществляемый как вирусспецифическими, так и клеточными протеазами.

Второй способ формирования белков характерен для ДНК-содержащих вирусов и большинства РНК-содержащих вирусов. При этом способе синтезируются короткие моноцистронные иРНК в результате избирательной транскрипции одного участка генома (гена). Однако эти вирусы широко используют механизм посттрансляционного нарезания белка.

В эукариотической клетке многие белки, в том числе вирусные, подвергаются посттрансляционным модификациям, зрелые функционально активные белки часто неидентичны их вновь синтезированным предшественникам. Широко распространены такие посттрансляционные ковалентные модификации, как гликозилирование, ацилирование, метилирование, сульфирование (образование дисульфидных связей), протеолитическое нарезание и, наконец, фосфорилирование. В результате вместо 20 генетически закодированных аминокислот из различных клеток разных органов эукариотов выделено около 140 дериватов аминокислот.

Гликозилирование . В составе сложно устроенных PHК — и ДНК-содержащих вирусов имеются белки, содержащие ковалентно присоединенные боковые цепочки углеводов, - гликопротеиды. Гликопротеиды расположены в составе вирусных оболочек и находятся на поверхности вирусных частиц.

Гликозилирование полипептидов - сложный многоступенчатый процесс, первые этапы которого начинаются уже в процессе синтеза полипептидов, и первый углеводный остаток присоединяется к полипептидной цепи, еще не сошедшей с рибосомы. Последующие этапы гликозилирования происходят путем последовательного присоединения углеводных остатков к углеводной цепочке в процессе транспорта полипептида к плазматической мембране. Углеводные остатки присоединяются по одному, и только при инициации синтеза олигосахаридной цепи переносится «блок». Окончательное формирование углеводной цепочки может завершаться на плазматической мембране перед сборкой вирусной частицы.

Гликозилирование влияет на транспорт, более того, транспорт неразрывно связан для гликопротеидов со стадийным гликозилированием. Убедительным доказательством этого служит влияние на вирусную репродукцию ингибиторов гликозилирования; они полностью подавляют транспорт полипептидов, не нарушая и не ингибируя их синтеза.

При подавлении гликозилирования соответствующими ингибиторами (аналоги сахаров типа 2-дезоксиглкжозы, антибиотик туникамицин) блокируется сборка вирионов миксо-, рабдо-, α-вирусов или образуются неинфекционные вирионы вирусов герпеса и онковирусов.

Сульфирование . Некоторые белки сложно устроенных РНК — и ДНК-содержащих вирусов сульфируются после трансляции. Чаще всего сульфированию подвергаются гликопротеиды, при этом сульфатная группа связывается с углеводными остатками гликопротеида.

Ацилирование . Ряд гликопротеидов сложно устроенных РНК-содержащих вирусов (НА2 вируса гриппа, белок G вируса везикулярного стоматита, белок HN вируса ньюкаслской болезни и др.) содержат ковалентно связанные 1-2 молекулы жирных кислот.

Нарезание . Многие вирусные белки, и в первую очередь гликопротеиды, приобретают функциональную активность лишь после того, как произойдет их нарезание в специфических точках протеолитическими ферментами. Нарезание происходит либо с образованием двух функциональных белковых субъединиц (например, большая и малая субъединицы гемагглютинина вируса гриппа, два гликопротеида (Е2 и ЕЗ) вируса леса Семлики), либо с образованием одного функционально активного белка и неактивного фермента, например белки F и HN парамиксовирусов. Нарезание обычно осуществляется клеточными ферментами. У многих сложно устроенных вирусов животных, имеющих гликопротеиды, нарезание необходимо для формирования активных прикрепительных белков и белков слияния и, следовательно, для приобретения вирусами способности инфицировать клетку. Лишь после нарезания этих белков вирусная частица приобретает инфекционную активность. Таким образом, можно говорить о протеолитической активации ряда вирусов, осуществляемой с помощью клеточных ферментов.

Фосфорилирование . Фосфопротеиды содержатся практически в составе всех вирусов животных - РНК — и ДНК-содержащих, просто и сложно устроенных. В составе большинства вирусов обнаружены протеинкиназы, однако фосфорилирование может осуществляться как вирусными, так и клеточными ферментами. Обычно фосфорилируются белки, связанные с вирусным геномом и осуществляющие регулирующую роль в его экспрессии. С процессом фосфорилирирования связан механизм активного действия интерферона.

Фосфорилирование белков играет регулирующую роль в транскрипции и трансляции вирусных и PHК, специфическом узнавании вирусных иРНК рибосомой, белок-нуклеиновом и белок-белковом узнавании на стадии сборки вирусных частиц.

III. Репликация . Это - синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному.

Различные вирусы имеют разные типы вирусного генома. Так, у ДНК-содержащих вирусов различают: двуспиральную линейную ДНК (адено-, герпес-, поксвирусы;), двуспиральную кольцевую ДНК (паповавирусы); односпиральная линейная ДНК (парвовирусы). У РНК-содержащих вирусов различают: двуспиральную сегментированную РНК (реовирусы); односпиральную плюсРНК (пикорна-, кальци-, тога-, флави-, коронавирусы); односпиральную минусРНК (ортомиксо-, парамиксо-, рабдо-, фило-, бунья — вирусы); односпиральную плюсРНК-матрицу для синтеза ДНК-провируса (ретровирусы). Особенности механизма репликации вирусов зависят от типа вирусного генома.

Репликация вирусов в двуспиральной ДНК сходна с репликацией клеточной ДНК. Репликация происходит на расплетенных участках ДНК и идет одновременно на обеих нитях от 5′-конца к 3′-концу. Репликацию осуществляют ДНК-полимеразы. Каждая вновь синтезированная молекула ДНК состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной нити.

При репликации вирусов с односпиральной ДНК происходит образование двуспиральных форм, которые представляют собой промежуточные репликативные формы, на минус-нитях которых синтезируются дочерние плюс-нити ДНК.

У вирусов, геном которых представлен односпиральной РНК, ее репликация происходит по следующей схеме: на вирионной РНК синтезируется комплементарная ей РНК (образуется репликативная форма РНК), затем на комплементарной РНК синтезируется комплементарная ей, но идентичная исходной вирусная РНК.

В клетках нет ферментов, способных осуществлять репликацию РНК, поэтому ферменты, участвующие в репликации, всегда вирусспецифические.

Репликация двуспиральных вирусных РНК происходит следующим образом: на минус-нити геномной двуспиральной РНК синтезируются односпиральные плюс-нити, которые являются и PH К и матрицей для синтеза минус-нитей, в результате образуются двуспиральные вирусные РНК.

Репликация односпиральной РНК ретровирусов происходит с участием фермента обратной транскриптазы. Вначале на вирусной РНК синтезируется комплементарная ей минус-нить ДНК, а затем (после разрушения РНК) на ней синтезируется плюс-нить ДНК. Двуспиральная ДНК интегрирует в хромосому клетки. Вирусспецифическая ДНК, встроенная в клеточный геном, транскрибируется с образованием вирусной РНК, которая вначале выполняет функции иРНК, направляя синтез вирусспецифических белков, а затем соединяется с ними, формируя новое поколение вирионов.

Синтез РНК может осуществляться по одному из двух механизмов: 1) консервативному, при котором полинуклеотидные цепи, входящие в состав репликативной формы РНК, сохраняются (консервируются) и не переходят в односпиральную форму; 2) образование плюс-нитей может происходить асимметрическим полуконсервативным путем, когда вновь строящаяся плюс-нить вытесняет ранее синтезированную плюс-нить из репликативной формы РНК.

IV. Сборка вирусных частиц . Синтез компонентов (нуклеиновых кислот и белков) вирусных частиц в клетке разобщен и может протекать в разных структурах ядра и цитоплазмы. Как только их концентрация достигнет определенного уровня, начинается сборка вирионов. При таком дисъюнктивном способе репродукции образование вирусных частиц возможно лишь при специфическом узнавании вирусных нуклеиновых кислот и белков и самопроизвольного их соединения друг с другом, т. е. вирусные компоненты способны к самосборке в результате гидрофобных, ионных, водородных связей и стерического соответствия.

Разнообразие структуры вирусов отражается на способе их формирования и выходе из клетки. У просто устроенных вирусов формируются провирионы, которые затем в результате модификаций белков превращаются в вирионы. У сложно устроенных вирусов сборка осуществляется многоступенчато - сначала формируются нуклеокапсиды, или сердцевины, с которыми взаимодействуют белки наружных оболочек. Сборка нуклеотидов, сердцевин, провирионов и вирионов происходит в специальных структурах клетки («фабриках»).

Различают две стратегии, используемые вирусами при сборке, созревании и выходе из зараженной клетки. Первая заключается в сборке и созревании вирионов внутри клетки (пикорна-, адено-, реовирусы и др.). Вторая состоит в сочетании завершающей стадии сборки вириона с выходом его из зараженной клетки. Она используется обычно вирусами, имеющими оболочку (тога-, ретро-, герпесвирусы и др.). Образование зрелых вирионов у оболочечных вирусов осуществляется при почковании их нуклеопротеидов через модифицированные участки цитоплазматических или ядерных (герпесвирусы) мембран, в которых клеточные белки заменены вирусспецифическими. Во время этого процесса вновь образовавшийся вирион отпочковывается от клетки.

Дозревание ретровирусов происходит после отпочковывания от плазматической мембраны клетки.

Число инфицированных вирусных частиц, образуемых в одной клетке, зависит от типа вируса, вида клеток, и количество их варьирует очень широко. Считают, что на долю вирусспецифических продуктов приходится от 0,1 до 5 % массы клетки животного, а на бактериофаги - до 40 % массы клетки хозяина. В инфицированных клетках вирусные нуклеиновые кислоты и вирусспецифические белки синтезируются в значительно большем количестве, чем включаются в вирионы.

V. Выход вирусных частиц из клетки . Существует два способа выхода вирусного потомства из клетки: путем взрыва и путем почкования. Выход из клетки путем взрыва связан с деструкцией клетки, нарушением ее целостности, в результате чего находящиеся внутри клетки зрелые вирусные частицы оказываются в окружающей среде. Такой способ выхода из клетки присущ вирусам, не содержащим липопротеидной оболочки (пикорна-, рео-, парво-, папова-, аденовирусы). Однако некоторые из этих вирусов могут транспортироваться на клеточную поверхность до гибели клетки.

Выход из клетки путем почкования присущ вирусам, содержащим липопротеидную мембрану, которая является дериватом клеточных мембран. При этом способе клетка может длительное время сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство, пока не произойдет полное истощение ее ресурсов.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter .

Подборка по базе: Ответы на вопросы по тесту по БЖД.docx , ИИСиТ - вопросы 2018 ответы.docx , Контрольные вопросы для самостоятельной подготовки.docx , менеджмент теория вопросы.docx , ДКБ вопросы к экзамену.docx , 30 ответов на вопросы о беге.pdf , Тестовые вопросы.docx , тесты, вопросы 8РЯ.doc , Контрольные вопросы и задания с ответами для допуска к компьютер , Деловые и науч ком Темы. Вопросы к зачету.doc .
СОДЕРЖАНИЕ

Контрольные вопросы:

1. Репродукция ДНК-геномных вирусов: основные этапы, особенности репродукции…………………………………………………..……........……...3

2. Признаки репродукции вирусов в живых системах: лабораторные животные, куриные эмбрионы, культуры клеток…………………………………………......……………………..………16

3. Задача....................................................................................................20

Список литературы……………………………...……………………...........25

1.Репродукция ДНК-геномных вирусов: основные этапы, особенности репродукции

Репродукция вирусов

Процесс репродукции вирусов может быть условно разделен на две фазы. Первая фаза охватывает события , которые ведут к адсорбции и проникновению вируса в клетку, освобождению его внутреннего компонента и модификации его таким образом, что он способен вызвать инфекцию. Соответственно, первая фаза включает в себя три стадии: 1) адсорбция вируса на клетках; 2) проникновение вируса в клетки; 3) раздевание вируса в клетке. Эти стадии направлены на то, чтобы вирус был доставлен в соответствующие клеточные структуры, и его внутренний компонент был освобожден от защитных оболочек. Как только эта цель достигнута, начинается вторая фаза репродукции, в течение которой происходит экспрессия вирусного генома. Эта фаза включает в себя стадии: 1) транскрипции, 2) трансляции информационных РНК, 3) репликации генома, 4) сборки вирусных компонентов. Заключительной стадией репродукции является выход вируса из клетки.

Первая фаза репродукции.

I. Адсорбция вирионов на поверхности клетки.

Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. прикрепления вирусных частиц к клеточной поверхности. Процесс адсорбции возможен при наличии соответствующих рецепторов на поверхности клетки и «узнающих» их субстанций на поверхности вируса. Самые начальные процессы адсорбции имеют неспецифический характер, и в основе их может лежать электростатическое взаимодействие положительно и отрицательно заряженных группировок на поверхности вируса и клетки. Однако узнавание клеточных рецепторов вирусными белками, ведущее к прикреплению вирусной частицы к клетке, является высоко специфическим процессом. Белки на поверхности вируса, узнающие специфические группировки на плазматической мембране клетки и обусловливающие прикрепление к ним вирусной частицы, называются прикрепительными белками.

Вирусы используют рецепторы, предназначенные для прохождения в клетку необходимых для ее жизнедеятельности веществ: питательных веществ, гормонов, факторов роста и т. д. Рецепторы могут иметь разную химическую природу и представлять собой белки, углеводный компонент белков и липидов, липиды. Рецепторами для вирусов гриппа и парамиксовирусов является сиаловая кислота в составе гликопротеидов и гликолипидов (ганглиозидов), для рабдовирусов и реовирусов - также углеводный компонент в составе белков и липидов, для пикорнавирусов и аденовирусов - белки, для некоторых вирусов - липиды. Специфические рецепторы играют роль не только в прикреплении вирусной частицы к клеточной поверхности. Они определяют дальнейшую судьбу вирусной частицы, ее внутриклеточный транспорт и доставку в определенные участки цитоплазмы и ядра, где вирус способен инициировать инфекционный процесс. Вирус может прикрепиться и к неспецифическим рецепторам и даже проникнуть в клетку, однако только прикрепление к специфическому рецептору приведет к возникновению инфекции.

Прикрепление вирусной частицы к клеточной поверхности вначале происходит путем образования единичной связи вирусной частицы с рецептором. Однако такое прикрепление непрочно, и вирусная частица может легко оторваться от клеточной поверхности - обратимая адсорбция. Для того чтобы наступила необратимая адсорбция, должны появиться множественные связи между вирусной частицей и многими молекулами рецепторов, т. е. должно произойти стабильное мультивалентное прикрепление. Количество молекул клеточных рецепторов в участках адсорбции может доходить до 3000. Стабильное связывание вирусной частицы с клеточной поверхностью в результате мультивалентного прикрепления происходит благодаря возможности свободного перемещения молекул рецепторов в липидном бислое плазматической мембраны, которое определяется подвижностью, «текучестью» белково-липидного слоя. Увеличение текучести липидов является одним из наиболее ранних событий при взаимодействии вируса с клеткой, следствием которого является формирование рецепторных полей в месте контакта вируса с клеточной поверхностью и стабильное прикрепление вирусной частицы к возникшим группировкам.

Количество специфических рецепторов на поверхности клетки колеблется между 104 и 105 на одну клетку. Рецепторы ряда вирусов могут быть представлены лишь в ограниченном наборе клеток-хозяев, и этим может определяться чувствительность организма к данному вирусу. Например, пикорнавирусы адсорбируются только на клетках приматов. Рецепторы для других вирусов, напротив, широко представлены на поверхности клеток различных видов , как, например, рецепторы для ортомиксовирусов и парамиксовирусов, представляющие собой сиалил-содержащие соединения. Поэтому эти вирусы имеют относительно широкий диапазон клеток, на которых может происходить адсорбция вирусных частиц. Рецепторами для ряда тогавирусов обладают клетки исключительно широкого круга хозяев: эти вирусы могут адсорбироваться и инфицировать клетки как позвоночных, так и беспозвоночных.

II. Проникновение вируса в клетку.

Исторически сложилось представление о двух альтернативных механизмах проникновения в клетку вирусов животных - путем виропексиса (эндоцитоза) и путем слияния вирусной и клеточной мембран. Однако оба эти механизма не исключают, а дополняют друг друга

Термин «виропексис», означает, что вирусная частица попадает в цитоплазму в результате инвагинации участка плазматической мембраны и образования вакуоли, которая содержит вирусную частицу.

Рецепторный эндоцитоз. Виропексис представляет собой частный случай рецепторного или адсорбционного эндоцитоза. Этот процесс является обычным механизмом, благодаря которому в клетку поступают питательные и регуляторные белки, гормоны, липопротеины и другие вещества из внеклеточной жидкости. Рецепторный эндоцитоз происходит в специализированных участках плазматической мембраны, где имеются специальные ямки, покрытые со стороны цитоплазмы особым белком с большой молекулярной массой - клатрином. На дне ямки располагаются специфические рецепторы. Ямки обеспечивают быструю инвагинацию и образование покрытых клатрином внутриклеточных вакуолей. Полупериод проникновения вещества внутрь клетки по этому механизму не превышает 10 мин с момента адсорбции. Количество образующихся в одну минуту вакуолей достигает более 2000. Таким Образом, рецепторный эндоцитоз представляет собой хорошо слаженный механизм, который обеспечивает быстрое проникновение в клетку чужеродных веществ.

Покрытые вакуоли сливаются с другими, более крупными цитоплазматическими вакуолями, образуя рецептосомы, содержащие рецепторы, но не содержащие клатрин, а те в свою очередь сливаются с лизосомами. Таким путем проникшие в клетку белки обычно транспортируются в лизосомы, где происходит их распад на аминокислоты; они могут и миновать лизосомы, и накапливаться в других участках клетки в недеградированной форме. Альтернативой рецепторного эндоцитоза является жидкостный эндоцитоз, когда инвагинация происходит не в специализированных участках мембраны. Большинство оболочечных и безоболочечных вирусов животных проникает в клетку по механизму рецепторного эндоцитоза. Эндоцитоз обеспечивает внутриклеточный транспорт вирусной частицы в составе эндоцитарной вакуоли, поскольку вакуоль может двигаться в любом направлении и сливаться с клеточными мембранами (включая ядерную мембрану), освобождая вирусную частицу в соответствующих внутриклеточных участках. Таким путем, например, ядерные вирусы попадают в ядро, а реовирусы - в лизосомы. Однако проникшие в клетку вирусные частицы находятся в составе вакуоли и отделены от цитоплазмы ее стенками. Им предстоит пройти ряд этапов, прежде чем они смогут вызвать инфекционный процесс.

Слияние вирусной, и клеточной мембран. Для того чтобы внутренний компонент вируса мог пройти через клеточную мембрану, вирус использует механизм слияния мембран. У оболочечных вирусов слияние обусловлено точечным взаимодействием вирусного белка слияния с липидами клеточной мембраны, в результате которого вирусная липопротеидная оболочка интегрирует с клеточной мембраной, а внутренний компонент вируса оказывается по другую ее сторону. У безоболочечных вирусов один из поверхностных белков также взаимодействует с липидами клеточных мембран, в результате чего внутренний компонент проходит через мембрану. Большинство вирусов животных выходит в цитозол из рецептосомы.

Если при эндоцитозе вирусная частица является пассивным пассажиром, то при слиянии она становится активным участником процесса. Белком слияния является один из ее поверхностных белков. К настоящему времени этот белок идентифицирован лишь у парамиксовирусов и ортомиксовирусов. У парамиксовирусов этот белок (Р-белок) представляет собой один из двух гликопротеидов, находящихся на поверхности вирусной частицы. Функцию белка слияния у вируса гриппа выполняет малая гемагглютинирующая субъединица.

Парамиксовирусы вызывают слияние мембран при нейтральном рН, и внутренний компонент этих вирусов может проникать в клетку непосредственно через плазматическую мембрану. Однако большинство оболочечных и безоболочечных вирусов вызывают слияние мембран только при низком значении рН - от 5,0 до 5,75. Если к клеткам добавить слабые основания (хлорид аммония, хлороквин и др.), которые в эндоцитарных вакуолях повышают рН до 6,0, слияния мембран не происходит, вирусные частицы остаются в вакуолях , и инфекционный процесс не возникает. Строгая зависимость слияния мембран от значений рН обусловлена конформационными изменениями вирусных белков слияния.

В лизосоме постоянно имеется низкое значение рН (4,9). В эндоцитарной вакуоли (рецептосоме) закисление создается за счет АТФ-зависимого «протонового насоса» еще на клеточной поверхности при образовании покрытой вакуоли. Закисление эндоцитарной вакуоли имеет большое значение для проникающих в клетку физиологических лигандов, так как низкое значение рН способствует диссоциации лиганда от рецептора и рециркуляции рецепторов.

Тот же механизм, который лежит в основе слияния вирусных и клеточных мембран, обусловливает индуцированный вирусами гемолиз и слияние плазматических мембран прилежащих друг к другу клеток с образованием многоядерных клеток, симпластов и синцитиев. Вирусы вызывают два типа слияния клеток: 1) «слияние снаружи» и 2) «слияние изнутри». «Слияние снаружи» происходит при высокой множественности инфекции и обнаруживается в течение первых часов после заражения. Этот тип слияния, описанный для парамиксовирусов, обусловлен белками заражающего вируса и не требует внутриклеточного синтеза вирусных компонентов. Напротив, «слияние изнутри» происходит при низкой множественности инфекции, обнаруживается на сравнительно поздних стадиях инфекционного процесса и обусловлено вновь синтезированными вирусными белками. «Слияние изнутри» описано для многих вирусов: вирусов герпеса, онковирусов, возбудителей медленных инфекций и др. Этот тип слияния вызывают те же вирусные гликопротеиды, которые обеспечивают проникновение вируса в клетку.

III. Раздевание - депротеинизация вируса

Проникшие в клетку вирусные частицы должны раздеться для того, чтобы вызвать инфекционный процесс. Смысл раздевания заключается в удалении вирусных защитных оболочек, которые препятствуют экспрессии вирусного генома. В результате раздевания освобождается внутренний компонент вируса, который способен вызвать инфекционный процесс. Раздевание сопровождается рядом характерных особенностей: в результате распада вирусной частицы исчезает инфекционная активность, в ряде случаев появляется чувствительность к нуклеазам, возникает устойчивость к нейтрализующему действию антител, теряется фоточувствительность при использовании ряда препаратов.

Конечными продуктами раздевания являются сердцевины, нуклеокапсиды или нуклеиновые кислоты. Для ряда вирусов было показано, что продуктом раздевания являются не голые нуклеиновые кислоты, а нуклеиновые кислоты, связанные с внутренним вирусным белком. Например, конечным продуктом раздевания пикорнавирусов является РНК, ковалентно связанная с белком VРg, конечным продуктом раздевания аденовирусов является ДНК, ковалентно связанная с одним из внутренних вирусных белков.

В ряде случаев способность вирусов вызвать инфекционный процесс определяется возможностью их раздевания в клетке данной системы. Тем самым эта стадия является одной из стадий, лимитирующих инфекцию.

Раздевание и внутриклеточный транспорт являются взаимосвязанными процессами: при нарушении правильного внутриклеточного транспорта к местам раздевания вирусная частица попадает в лизосому и разрушается лизосомальными ферментами.

Вторая фаза репродукции .

I. Транскрипция.

Транскрипция осуществляется с помощью специального фермента - РНК-полимеразы, который связывает нуклеотиды путем образования 3-5´фосфодиэфирных мостиков. Такое связывание происходит лишь в присутствии ДНК-матрицы.

Продуктами транскрипции в клетке являются иРНК. Сама клеточная ДНК, являющаяся носителем генетической информации, не может непосредственно программировать синтез белка. Передачу генетической информации от ДНК к рибосомам осуществляет РНК-посредник. На этом основана центральная догма молекулярной биологии, которая выражается следующей формулой:

ДНК - транскрипция - РНК - трансляция - белок,

где стрелки показывают направление переноса генетической информации.

Реализация генетической информации у вирусов. Стратегия вирусного генома в отношении синтеза иРНК у разных вирусов различна. У ДНК-содержащих вирусов иРНК синтезируется на матрице одной из нитей ДНК. Формула переноса генетической информации у них такая же, как и в клетке:

ДНК - транскрипция - РНК - трансляция - белок.

ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происходит в ядре, используют для транскрипции клеточную полимеразу. К этим вирусам относятся паповавирусы, аденовирусы, вирусы герпеса. ДНК-содержащие вирусы, репродукция которых происходит в цитоплазме, не могут использовать клеточный фермент , находящийся в ядре. Транскрипция их генома осуществляется вирусспецифическим ферментом - ДНК-полимеразой, которая проникает в клетку в составе вируса. К этим вирусам относятся вирусы оспы и иридовирусы.

Ферменты, транскрибирующие вирусный геном. Транскрипция ряда ДНК-содержащих вирусов - паповавирусов, аденовирусов, вирусов герпеса, парвовирусов, гепаднавирусов. Осуществляется в ядре клетки, и в этом процессе широко используются механизмы клеточной транскрипции - ферменты транскрипции и дальнейшей модификации транскриптов. Транскрипция этих вирусов осуществляется клеточной РНК-полимеразой II - ферментом, который осуществляет транскрипцию клеточного генома. Однако особая группа транскриптов аденовируса синтезируется с помощью другого клеточного фермента - РНК-полимеразы III. У двух других семейств ДНК-содержащих вирусов животных - вирусов оспы и иридовирусов - транскрипция происходит в цитоплазме. Поскольку в цитоплазме нет клеточных полимераз, транскрипция этих вирусов нуждается в специальном вирусном ферменте - вирусной РНК-полимеразе. Этот фермент является структурным вирусным белком.

Регуляция транскрипции. Транскрипция вирусного генома строго регулируется на протяжении инфекционного цикла. Регуляция осуществляется как клеточными, так и вирусспецифическими механизмами. У некоторых вирусов, в основном ДНК-содержащих, существует три периода транскрипций - сверхранняя, ранняя и поздняя. К этим вирусам относятся вирусы оспы, герпеса, паповавирусы, аденовирусы. В результате сверхранней и ранней транскрипции избирательно считываются сверхранние и ранние гены с образованием сверхранних или ранних иРНК. При поздней транскрипции считывается другая часть вирусного генома - поздние гены, с образованием поздних иРНК. Количество поздних генов обычно превышает количество ранних генов. Многие сверхранние гены являются генами для неструктурных белков - ферментов и регуляторов транскрипции и репликации вирусного генома. Напротив, поздние гены обычно являются генами для структурных белков. Обычно при поздней транскрипции считывается весь геном, но с преобладанием транскрипции поздних генов.

Продуктом сверхранней транскрипции вирусов герпеса являются А-белки. Функция одного или нескольких из них необходима для транскрипции следующей группы генов, кодирующих Р-белки. В свою очередь Р-белки включают транскрипцию последней группы поздних генов, кодирующих У-белки. Такой тип регуляции получил название «каскадной».

II. Трансляция.

Это - процесс перевода генетической информации, содержащейся в иРНК на специфическую последовательность аминокислот в синтезируемых вирусспецифических белках. Синтез белка в клетке происходит в результате трансляции иРНК на рибосомах. В рибосомах идет слияние потока информации (в иРНК) с потоком аминокислот, которые приносят транспортные РНК (тРНК). В клетке существует большое количество разнообразных тРНК. Для каждой аминокислоты должна быть своя тРНК.

Молекула тРНК представляет собой односпиральную РНК со сложной структурой в виде кленового листа.

Процесс транскрипции состоит из трех фаз: инициации элонгации, терминации.

Гликозилирование. В составе сложно устроенных PHК - и ДНК-содержащих вирусов имеются белки, содержащие ковалентно присоединенные боковые цепочки углеводов, - гликопротеиды. Гликопротеиды расположены в составе вирусных оболочек и находятся на поверхности вирусных частиц.

Гликозилирование влияет на транспорт, более того, транспорт неразрывно связан для гликопротеидов со стадийным гликозилированием. Убедительным доказательством этого служит влияние на вирусную репродукцию ингибиторов гликозилирования ; они полностью подавляют транспорт полипептидов, не нарушая и не ингибируя их синтеза.

Сульфирование. Некоторые белки сложно устроенных РНК - и ДНК-содержащих вирусов сульфируются после трансляции. Чаще всего сульфированию подвергаются гликопротеиды, при этом сульфатная группа связывается с углеводными остатками гликопротеида.

Ацилирование. Ряд гликопротеидов сложно устроенных РНК-содержащих вирусов (НА2 вируса гриппа, белок G вируса везикулярного стоматита, белок HN вируса ньюкаслской болезни и др.) содержат ковалентно связанные 1-2 молекулы жирных кислот.

Нарезание. Многие вирусные белки, и в первую очередь гликопротеиды, приобретают функциональную активность лишь после того, как произойдет их нарезание в специфических точках протеолитическими ферментами. Нарезание происходит либо с образованием двух функциональных белковых субъединиц (например, большая и малая субъединицы гемагглютинина вируса гриппа, два гликопротеида (Е2 и ЕЗ) вируса леса Семлики), либо с образованием одного функционально активного белка и неактивного фермента, например белки F и HN парамиксовирусов. Нарезание обычно осуществляется клеточными ферментами. У многих сложно устроенных вирусов животных, имеющих гликопротеиды, нарезание необходимо для формирования активных прикрепительных белков и белков слияния и, следовательно, для приобретения вирусами способности инфицировать клетку. Лишь после нарезания этих белков вирусная частица приобретает инфекционную активность. Таким образом, можно говорить о протеолитической активации ряда вирусов, осуществляемой с помощью клеточных ферментов.

Фосфорилирование. Фосфопротеиды содержатся практически в составе всех вирусов животных - РНК - и ДНК-содержащих, просто и сложно устроенных. В составе большинства вирусов обнаружены протеинкиназы, однако фосфорилирование может осуществляться как вирусными, так и клеточными ферментами. Обычно фосфорилируются белки, связанные с вирусным геномом и осуществляющие регулирующую роль в его экспрессии. С процессом фосфорилирирования связан механизм активного действия интерферона.

III. Репликация.

Репликацией называется синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному. В клетке происходит репликация ДНК, в результате которой образуются дочерние двунитчатые ДНК. Репликация происходит на расплетенных участках ДНК и идет одновременно на обеих нитях от 5′-конца к 3′-концу.

Поскольку две нити ДНК имеют противоположную полярность, а участок репликации («вилка») движется в одном направлении, одна цепь строится в обратном направлении отдельными фрагментами, которые называются фрагментами Оказаки (по имени ученого, впервые предложившего такую модель). После синтеза фрагменты Оказаки «сшиваются» лигазой в единую нить.

Репликация ДНК осуществляется ДНК-полимеразами. Для начала репликации необходим предварительный синтез короткого участка РНК на матрице ДНК, который называется затравкой. С затравки начинается синтез нити ДНК, после чего РНК быстро удаляется с растущего участка.

Репликация вирусных ДНК. Репликация генома ДНК-содержащих вирусов в основном катализируется клеточными фрагментами и механизм ее сходен с механизмом репликации клеточной ДНК.

Каждая вновь синтезированная молекула ДНК состоит из одной родительской и одной вновь синтезированной нити. Такой механизм репликации называется полуконсервативным.

У вирусов, содержащих кольцевые двунитчатые ДНК (паповавирусы), разрезается одна из нитей ДНК, что ведет к раскручиванию и снятию супервитков на определенном участке молекулы.

Видна нижняя суперспирализованная часть молекулы, расплетенная часть на большом участке и вновь образуемые репликационные петли.

При репликации однонитчатых ДНК (семейство парвовирусов) происходит образование двунитчатых форм, которые представляют собой промежуточные репликативные формы.

Репликативные комплексы. Поскольку образующиеся нити ДНК и РНК некоторое время остаются связанными с матрицей, в зараженной клетке формируются репликативные комплексы, в которых осуществляется весь процесс репликации (а в ряде случаев также и транскрипции) генома. Репликативный комплекс содержит геном, репликазу и связанные с матрицей вновь синтезированные цепи нуклеиновых кислот. Вновь синтезированные геномные молекулы немедленно ассоциируются с вирусными белками, поэтому в репликативных комплексах обнаруживаются антигены. В процессе репликации возникает частично двунитчатая структура с однонитчатыми «хвостами», так называемый репликативный предшественник.

Репликативные комплексы ассоциированы с клеточными структурами либо с предсуществующими, либо вирусиндуцируемыми. Например, репликативные комплексы пикорнавирусов ассоциированы с мембранами эндоплазматической сети , вирусов оспы - с цитоплазматическим матриксом, репликативные комплексы аденовирусов и вирусов герпеса в ядрах находятся в ассоциации со вновь сформированными волокнистыми структурами и связаны с ядерными мембранами. В зараженных клетках может происходить усиленная пролиферация клеточных структур, с которыми связаны репликативные комплексы, или их формирование из предсуществующего материала. Например, в клетках, зараженных пикорнавирусами, происходит пролиферация гладких мембран. В клетках, зараженных реовирусами, наблюдается скопление микротрубочек; в клетках, зараженных вирусами оспы, происходит формирование цитоплазматического матрикса.

В репликативных комплексах одновременно с синтезом геномных молекул осуществляется транскрипция и происходит сборка нуклеокапсидов и сердцевин, а при некоторых инфекциях - и вирусных частиц.

Регуляция репликации. Вновь образованная молекула геномной РНК может быть использована различным образом. Она может ассоциироваться с капсидными белками и войти в состав вириона, служить матрицей для синтеза новых геномных молекул, либо - для образования иРНК, наконец, у «плюс»-нитевых вирусов она может выполнять функции иРНК и связываться с рибосомами. В клетке существуют механизмы, регулирующие использование геномных молекул. Регуляция идет по принципу саморегуляции и реализуется путем взаимодействия вирусных РНК и белков благодаря возможности белок-нуклеинового и белок-белкового узнавания. Например, роль терминального белка пикорнавирусов заключается в запрещении трансляции иРНК и отборе молекул для формирования вирионов. Белок, связывающийся с 5′-концом геномной РНК, в свою очередь узнается капсидными белками и служит сигналом для сборки вирусной частицы с участием данной молекулы РНК. По тому же принципу отбираются геномные молекулы РНК у «минус»-нитевых вирусов. Молекула РНК входит в состав вириона или служит матрицей для репликации. Для переключения ее на транскрипцию должен возникнуть запрет белок-нуклеинового взаимодействия. В репликации ДНК аденовирусов участвует молекула белка, которая связывается с концом вирусной ДНК и необходима для начала репликации. Таким образом, для начала репликации необходим синтез вирусных белков: в присутствии ингибиторов белкового синтеза отсутствует переключение транскрипции на репликацию.

IV. Сборка вирусных частиц.

Синтез компонентов вирусных частиц в клетке разобщен и может протекать в разных структурах ядра и цитоплазмы. Вирусы, репликация которых проходит в ядрах, условно называют ядерными. В основном это ДНК-содержащие вирусы: аденовирусы, паповавирусы, парвовирусы, вирусы герпеса.

Вирусы, реплицирующиеся в цитоплазме, называют цитоплазматическими. К ним относятся из ДНК-содержащих вирус оспы и большинство РНК-содержащих вирусов, за исключением ортомиксовирусов и ретровирусов. Однако это разделение весьма относительно, потому что в репродукции тех и других вирусов есть стадии, протекающие соответственно в цитоплазме и ядре.

Внутри ядра и цитоплазмы синтез вирусспецифических молекул также может быть разобщен. Так, например, синтез одних белков осуществляется на свободных полисомах, а других - на полисомах, связанных с мембранами. Вирусные нуклеиновые кислоты синтезируются в ассоциации с клеточными структурами вдали от полисом, которые синтезируют вирусные белки. При таком дисъюнктивном способе репродукции образование вирусной частицы возможно лишь в том случае, если вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью при достаточной концентрации узнавать друг друга в многообразии клеточных белков и нуклеиновых кислот и самопроизвольно соединяться друг с другом, т. е. способны к самосборке.

В основе самосборки лежит специфическое белок-нуклеиновое и белок-белковое узнавание, которое может происходить в результате гидрофобных, солевых и водородных связей, а также стерического соответствия. Белок-нуклеиновое узнавание ограничено небольшим участком молекулы нуклеиновой кислоты и определяется уникальными последовательностями нуклеотидов в некодирующей части вирусного генома. С этого узнавания участка генома вирусными капсидными белками начинается процесс сборки вирусной частицы. Присоединение остальных белковых молекул осуществляется за счет специфических белок-белковых взаимодействий или неспецифических белок-нуклеиновых взаимодействий.

В связи с разнообразием структуры вирусов животных разнообразны и способы формирования вирионов, однако можно сформулировать следующие общие принципы сборки:

У просто устроенных вирусов формируются провирионы, которые затем в результате модификаций белков превращаются в вирионы. У сложно устроенных вирусов сборка осуществляется многоступенчато. Сначала формируются нуклеокапсиды или сердцевины, с которыми взаимодействуют белки наружных оболочек.

Сборка сложно устроенных вирусов (за исключением сборки вирусов оспы и реовирусов) осуществляется на клеточных мембранах. Сборка ядерных вирусов происходит с участием ядерных мембран, сборка цитоплазматических вирусов - с участием мембран эндоплазматической сети или плазматической мембраны, куда независимо друг от друга прибывают все компоненты вирусной частицы.

У ряда сложно устроенных вирусов существуют специальные гидрофобные белки, выполняющие функции посредников между сформированными нуклеокапсидами и вирусными оболочками. Такими белками являются матриксные белки у ряда «минус»-нитевых вирусов (ортомиксовирусов, парамиксовирусов, рабдовирусов).

Сборка нуклеокапсидов, сердцевин, провирионов и вирионов происходит не во внутриклеточной жидкости, а в , предсуществующих в клетке или индуцированных вирусом («фабриках»).

Сложно устроенные вирусы для построения своих частиц используют ряд элементов клетки-хозяина, например липиды, некоторые ферменты, у ДНК-геномного 5V40 - гистоны, у оболочечных РНК-геномных вирусов - актин, а в составе ареновирусов обнаружены даже рибосомы. Клеточные молекулы несут определенные функции в вирусной частице, однако включение их в вирион может явиться и следствием случайной контаминации, как, например, включение ряда ферментов клеточных оболочек или клеточных нуклеиновых кислот.

Сборка ДНК-содержащих вирусов. В сборке ДНК-содержащих вирусов есть некоторые отличия от сборки РНК-содержащих вирусов. Как и у РНК-содержащих вирусов, сборка ДНК-содержащих вирусов является многоступенчатым процессом с образованием промежуточных форм, отличающихся от зрелых вирионов по составу полипептидов. Первый этап сборки заключается в ассоциации ДНК с внутренними белками и формировании сердцевин или нуклеокапсидов. При этом ДНК соединяется с предварительно сформированными «пустыми» капсидами.

В результате связывания ДНК с капсидами появляется новый класс промежуточных форм, которые называются неполными формами. Помимо неполных форм с разным содержанием ДНК, существует другая промежуточная форма в морфогенезе - незрелые вирионы, отличающиеся от зрелых тем, что содержат ненарезанные предшественники полипептидов. Таким образом, морфогенез вирусов тесно связан с модификацией (процессингом) белков.

Сборка ядерных вирусов начинается в ядре, обычно - с ассоциации с ядерной мембраной. Формирующиеся в ядре промежуточные формы вируса герпеса почкуются в перинуклеарное пространство через внутреннюю ядерную мембрану, и вирус приобретает таким путем оболочку, которая является дериватом ядерной мембраны. Дальнейшая достройка и созревание вирионов происходит в мембранах эндоплазматической сети и в аппарате Гольджи, откуда вирус в составе цитоплазматических везикул транспортируется на клеточную поверхность.

У непочкующихся липидсодержащих вирусов - вирусов оспы сборка вирионов происходит в уже описанных цитоплазматических вирусных «фабриках». Липидная оболочка вирусов в «фабриках» формируется из клеточных липидов путем автономной самосборки, поэтому липидный состав оболочек значительно отличается от состава липидов в клеточных мембранах.

V. Выход вирусных частиц из клетки.

Существуют два способа выхода вирусного потомства из клетки:

1) путем «взрыва»;

2) путем почкования.

Выход из клетки путем взрыва связан с деструкцией клетки, нарушением ее целостности, в результате чего находящиеся внутри клетки зрелые вирусные частицы оказываются в окружающей среде. Такой способ выхода из клетки присущ вирусам, не содержащим липопротеидной оболочки (пикорна-, рео-, парво-, папова-, аденовирусы). Однако некоторые из этих вирусов могут транспортироваться на клеточную поверхность до гибели клетки. Выход из клеток путем почкования присущ вирусам, содержащим липопротеидную мембрану, которая является дериватом клеточных мембран. При этом способе клетка может длительное время сохранять жизнеспособность и продуцировать вирусное потомство, пока не произойдет полное истощение ее ресурсов.

Ретровирусы - оболочечные, сферические вирусы, которые выходят почкованием через клеточную мембрану хозяина. Они имеют приблизительно 100 нм в диаметре. Геном состоит из двух идентичных линейных односпиральных молекул РНК. Икосаэдральный нуклеокапсид содержит спиральный рибонуклеопротеид и окружен оболочкой состоящей из гликопротеидов и липидов.

Характерная особенность ретровирусов - присутствие в вирионе необычного фермента - РНК зависимой ДНК полимеразы или обратной транскриптазы (отсюда имяretro, о значающее обратно). В отличие от классической транскрипции генетической информации от ДНК на РНК, фермент обратная транскриптаза готовит ДНК-копию РНК-генома ретровируса - первоначально РНК-ДНК гибрид, а затем его двухспиральную ДНК-форму. Двухспиральная ДНК-форма ретровирусного генома, называемаяпровирусом , и нтегрирует в ДНК инфицированной клетки-хозяина. Именно от провируса транслируются все ретровирусные белки. Заражение онкогенным ретровирусом не ведет к цитолизу или гибели инфицированных клеток, но провирус остается интегрированным в ДНК клетки-хозяина до конца жизни клетки и воспроизводится вместе с клеточным геномом при размножении клеток.

В то время как все онкогенные РНК-содержащие вирусы принадлежат семейству Retroviridae, н е все ретровирусы онкогенны. СемействоRetroviridae классифицируется на три подсемейства.

1. Oncovirinae включает все онкогенные РНК содержащие вирусы (прежде называемое онкорнавирус).
2. Spumavirinaeсодержит неонкогенные "пенистые вирусы" (spuma = пена) вызывающие бессимптомные инфекции у нескольких видов животных и представляющие собой загрязняющие примеси первичных культур клеток, в которых они вызывают пенистое перерождение.
3. Lentivirinaeвключает как вирусы вызывающие "замедленные инфекции" (lentus= медленно) у животных, так и вирусы человеческих и животных иммунодефицитов.

Ретровирусы широко распространены; их находят почти у всех позвоночных, включая животных, птиц и рептилий. Основываясь на круге хозяев и типах вызываемых болезней, онкогенные Ретровирусы можно разделить на следующие группы:

1. Вирусы лейкозно-саркоматозного комплекса птиц . Группа антигенно родственных вирусов, которые вызываютAvianлейкозы (вирусы лимфоматоза, миелобластоза и эритробластоза) или саркому у домашних птиц (вирус саркомы Рауса, ВСР).
2. Вирусы мышиных лейкозов. Эта группа состоит из нескольких штаммов вирусов мышиной лейкемии и вирусов саркомы, названных по имени исследователи впервые описавших их (например Гросс, Френд, Молони, Раушер).
3. Вирус опухоли молочной железы мышей. Этот вирус имеется в некоторых линиях мышей, у которых часто встречается рак молочной железы. Он известен как "молочный фактор" или "вирус Биттнера". Он размножается в молочной железе и передается от матери потомству через грудное молоко. Мыши могут быть заражены через рот, через подкожную или внутрибрюшинную инъекцию. Рак молочной железы развивается только у мышей восприимчивых линий после латентного периода в 6-12 месяцев.
4. Вирусы лейкозов и сарком других животных. Большое количество вирусов было выделено из лейкозов и сарком различных видов животных - кошек, хомяков, крыс, морских свинок и обезьян.
5. Т-лимфотропные вирусы человека (HTLV). Ретровирусы, названные "человеческие Т-лимфотропные вирусы" были выделены в 1980 из культур клеток от взрослых больных кожной T-клеточной лимфомой (грибковый микоз) и лейкемией (синдром Сезара) в США. Подобные вирусы были выделены от больных Т-клеточной лейкемией в Японии и Карибском бассейне. HTLV1-го типа имеются во всем мире, но распространенность заболеваний ограничена эндемичными областями. Помимо Т-клеточной лейкемии,HTLV-Iтакже связан с тропическим спастическим парапарезом, демиелинирующей болезнью. Вирус в основном инфицирует T4 (CD4) клетки. На инфицированных T-клетках обнаруживается большое количество рецепторов к ИЛ-2. Близко родственныеHTLV-IIтакже связаны с T-клеточными злокачественными новообразованиями. Известно, чтоHTLV-инфекция передается при переливании крови и другими способами введения лейкоцитов.

Видовая специфичность. Ретровирусы обычно поражают только один вид хозяина, специфика обусловлена главным образом присутствием вирусных рецепторов на поверхности клетки-хозяина. В зависимости от их способности расти в клетках другого вида, ретровирусы делятся на 1) экотропные (размножаются только в клетках естественного хозяина);

2) амфитропные (размножаются в клетках естественного и чужих видов); и 3) ксенотропные (размножаются только в клетках чужих видов, но не в клетках естественных хозяев).

Передача вирусов. Возможны два типа передачи ретровирусов. Экзогенные ретровирусы распространяются горизонтально. Большинство онкогенных ретровирусов являются экзогенными. Эндогенные ретровирусы передаются вертикально от родителей потомствупровирусом, интегированным в геном половых клеток. Эндогенный ретровирусный провирус ведет себя как клеточный ген и подчинен регулирующему влиянию клетки-хозяина. Эндогенные ретровирусы обычно "молчащие", не трансформируют клетки и не вызывают какое-либо заболевание. Они могут быть обнаружены либо из-за "активации" после воздействия радиации или химикатов, или методом гибридизации нуклеиновой кислоты.

Резистентность. Ретровирусы неустойчивы, инактивируются при 56 о С в течение 30 минут, слабыми кислотами, эфиром и формалином. Они устойчивы при - 30 о С

Морфология. Ретровирусы существуют в виде четырех морфологических типов. Частицы типа А существуют только внутри клеток. Они имеют 60-90 нм в диаметре и содержат кольцевидный нуклеоид, окруженный мембраной. Они могут являться формой предшественника других типов. Типы B, C и D являются внеклеточными. Диаметр В частицы - 100-130nm, с эксцентрическим нуклеоидом и несут поверхностные шипики. Частицы С типа имеют центральный нуклеоид и гладкую поверхностную мембрану. ЧастицыDтипа еще не охарактеризованы. Они имеют эксцентрический нуклеоид и несут короткие поверхностные шипики.

Большинство ретровирусов - частицы С типа. Вирус рака молочных железы мыши - частица типа B, а вирус рака молочной железы обезьян Мэзон-Пфайзера - частица типа D.

Антигены. Имеется два типа антигенов - типоспецифические гликопротеидные антигены, расположенные на оболочке, и группо-специфические нуклеопротеидные антигены, расположенные в ядре вириона. Перекрестные реакции между поверхностными антигенами ретровирусов от различных видов хозяев не наблюдаются.

Геномная структура. Ретровирусы имеют относительно простую геномную структуру.

Провирус стандартного ретровируса (такого как недефектный вирус лейкоза птиц или мышей) состоит из трех генов, требуемых для вирусной репликации - gag,pol, иenv. Ген gag кодирует белки нуклеокапсида, которые являются группоспецифическими антигенами , ген pol кодирует РНК-зависимую ДНК-полимеразу, ген env кодирует гликопротеиды оболочки. С обоих концов провируса имеется длинный концевой повтор (LTR), непосредственно связывающийся с ДНК клетки-хозяина. LTR-участки обеспечивают контроль регуляции функции генов провируса.

Некоторые ретровирусы (трансрегулирующие вирусы) типа HTLV или HIV несут четвертый ген tat после env гена. Это - трансактивирующий ген, который регулирует функцию вирусных генов.

Стандартные онкогенные ретровирусы типа вирусов хронической лейкемии является медленными трансформирующими вирусами, т о есть они имеют низкий онкогенный потенциал и стимулируют злокачественное преобразование вообще только клеток крови после длительного латентного периода. Они не трансформирует культивируемые клетки. Они способны к нормальной репликации. Напротив, острые трансформирующие вирусы - высоко онкогенны и вызывают злокачественное развитие после короткого латентного периода в недели или месяцы. Они могут вызывать различные типы сарком, карцином, лейкозов и также трансформировать клетки в культуре. Однако, наиболее сильные трансформирующие вирусы неспособны нормально реплицироваться, потому что они содержат в своем геноме дополнительный ген, вирусный онкоген (V-onc ген) который заменяет некоторых из генов, существенных для репликации вируса. ТакиеV-onc вирусы могут репродуцироваться только при коинфекции со стандартным помощником ретровируса. Вирус саркомы Рауса, который несет онкогенsrc (произносится "сарк"), наиболее хорошо изученный среди острых трансформирующих вирусов, отличается способностью реплицироваться, то есть он может нормально реплицироваться, потому что обладает полным комплектом gag, pol, и env генов. Большинство острых трансформирующих вирусов дефектны в отношении репликации.

Репродукция вирусов (от англ, reproduce . воспроизводить) осуществляется в несколько стадий, последовательно сменяющих друг друга:

· адсорбция вируса на клетке;

· проникновение вируса в клетку;

· «раздевание» вируса;

· биосинтез вирусных компонентов в клетке;

· формирование вирусов;

· выход вирусов из клетки

Адсорбция.

Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е.

прикрепления вирусов к поверхности клетки. Это высокоспецифический процесс. Вирус адсорбируется на определенных участках клеточной мембраны, так называемых, рецепторах.

Клеточные рецепторы могут иметь разную химическую природу, представляя собой белки, углеводные компоненты белков и липидов, липиды. Число специфических рецепторов на поверхности одной клетки колеблется от 104 до 105. Следовательно, на клетке могут адсорбироваться десятки и даже сотни вирусных частиц.

Поверхностные структуры вируса, «узнающие» специфические клеточные рецепторы и взаимодействующие с ними, называются прикрепительными белками. Обычно эту функцию выполняет один из поверхностных белков капсида или суперкапсида. Способность вирусов избирательно поражать определенные клетки органов и тканей организма называют тропизмом вирусов (от греч. tropos . направление).

Проникновение в клетку .

Существует два способа проникновения вирусов животных в клетку: виропексис и слияние вирусной оболочки с клеточной мембраной. При виропексисе после адсорбции вирусов происходят инвагинация (впячивание) участка клеточной мембраны и образование внутриклеточной вакуоли, которая содержит вирусную частицу. Вакуоль с вирусом может транспортироваться в любом направлении в разные участки цитоплазмы или ядро клетки. Процесс слияния осуществляется одним из поверхностных вирусных белков капсидной или суперкапсидной оболочки. По-видимому, оба механизма проникновения вируса в клетку не исключают, а дополняют друг друга.

«Раздевание» вируса

Процесс «раздевания» заключается в удалении защитных вирусных оболочек и

освобождении внутреннего компонента вируса, способного вызвать инфекционный процесс. «Раздевание» вирусов происходит постепенно, в несколько этапов, в определенных участках цитоплазмы или ядра клетки, для чего клетка использует набор специальных ферментов. В случае проникновения вируса путем слияния вирусной оболочки с клеточной мембраной процесс проникновения вируса в клетку сочетается с первым этапом его «раздевания». Конечными продуктами «раздевания» являются сердцевина, нуклеокапсид или нуклеиновая кислота вируса.

Биосинтез компонентов вируса .

Проникшая в клетку вирусная нуклеиновая кислота несет генетическую информацию, которая успешно конкурирует с генетической информацией клетки. Она дезорганизует работу клеточных систем, подавляет собственный метаболизм клетки и заставляет ее синтезировать новые вирусные белки и нуклеиновые кислоты, идущие на построение вирусного потомства. Реализация генетической информации вируса осуществляется в соответствии с хорошо известными из биологии процессами транскрипции (от лат.transcriptio . переписывание, т.е. синтез информационных РНК, комплементарных матричным ДНК или РНК), трансляции (от лат. translatio . передача, т. е. синтез белков на рибосомах клетки с участием иРНК) и репликации (от лат. replicatio . повторение, т. е. синтез молекул нуклеиновой кислоты, гомологичных геному). Поскольку генетический аппарат вирусов остаточно разнообразен, то передача наследственной информации в отношении синтеза иРНК различна. Основные схемы реализации вирусной генетической информации могут быть представлены следующим образом:

Для синтеза иРНК одни вирусы используют клеточные ферменты, другие - собственный набор ферментов (полимераз).

Вирусная нуклеиновая кислота кодирует синтез двух классов белков: неструктурных белков-ферментов, которые обслуживают процесс репродукции вирусов на разных его этапах, и структурных белков, которые войдут в состав вирусных частиц потомства. Синтез компонентов вируса (белков и нуклеиновых кислот) разобщен во времени и пространстве, т. е. протекает в разных структурах ядра и цитоплазмы клетки. Вот почему этот уникальный способ размножения вирусов называется дисъюнктивным (от лат. disjunctus - разобщенный).

Формирование (сборка) вирусов .

Синтезированные вирусные нуклеиновые кислоты и белки обладают способностью специфически узнавать друг друга и при достаточной их концентрации самопроизвольно соединяются в результате гидрофобных, ионных и водородных связей.

Существуют следующие общие принципы сборки вирусов, имеющих разную структуру:

· формирование вирусов является многоступенчатым процессом і с образованием промежуточных форм;

· сборка просто устроенных вирусов заключается во взаимодействии молекул вирусных нуклеиновых кислот с капсидными белками и образовании нуклеокапсидов (например, вирусы полиомиелита). У сложно устроенных вирусов сначала формируются нуклеокапсиды, с которыми взаимодействуют белки суперкапсидных оболочек (например, вирусы гриппа);

· формирование вирусов происходит не во внутриклеточной жидкости, а на ядерных или цитоплазматических мембранах клетки;

· сложно организованные вирусы в процессе формирования включают в свой состав компоненты клетки-хозяина (липиды, углеводы).

Выход вирусов из клетки.

Различают два основных типа выхода вирусного потомства из клетки. Первый тип. взрывной. характеризуется одновременным выходом большого

количества вирусов. При этом клетка быстро погибает. Такой способ выхода характерен для вирусов, не имеющих суперкапсидной оболочки. Второй тип - почкование. Он присущ вирусам, имеющим суперкапсидную оболочку. На заключительном этапе сборки нуклеокапсиды сложно устроенных вирусов фиксируются на клеточной плазматической мембране, модифицированной вирусными белками, и постепенно выпячивают ее. В результате выпячивания образуется «почка», содержащая нуклеокапсид. Затем «почка» отделяется от клетки. Таким образом, внешняя оболочка этих вирусов формируется в процессе их выхода из клетки. При таком механизме клетка может продолжительное время продуцировать вирус, сохраняя в той или иной мере свои основные функции.

Время, необходимое для осуществления полного цикла репродукции вирусов, варьирует от 5-6 ч (вирусы гриппа, натуральной оспы и др.) до нескольких суток (вирусы кори, аденовирусы и др.).

Образовавшиеся вирусы способны инфицировать новые клетки и проходить в них указанный выше цикл репродукции.

Питательные Среды. Требования, предъявляемые к питательным средам. Типы питательных сред.

Питательные среды должны содержать в достаточном количестве источники углерода, азота, неорганические соли, в ряде случаев - ростовые факторы (витамины, аминокислоты), быть влажными, чтобы процесс простой диффузии проходил без затруднения, прозрачными (по возможности), чтобы визуально или под микроскопом можно было наблюдать рост микробов, стерильными, иметь оптимальные концентрации водородных ионов (рН среды) и окислительно-восстановительный потенциал. Источником азота для микроорганизмов являются белки, но большинство микробов неспособны усваивать нативный белок, поэтому используются продукты кислотного и ферментного расщепления белка: пептон, казеин.

Исходными компонентами искусственной питательной среды является мясная вода, кислотный и ферментный гидролизат казеина, свернутой крови. К основе добавляют хлорид натрия, пептон

Мясная вода содержит минеральные вещества, углеводы, витамины. Для получения мясной воды нежирное мясо, очищенное от сухожилий, измельчают на мясорубке, заливают двойным объемом воды, кипятят на огне, фильтруют, доливают водопроводной воды до первоначального объема, разливают по бутылкам истерилизуют.

Казеин пищевой кислотный содержит полноценный набор аминокислот, характеризуется высокой питательностью, является отходом молочной промышленности. Из казеина готовят перевар.

Пептон – продукт неполного переваривания белка, содержит альбумозы, пептоны и полипептиды аминокислот в незначительном количестве, состав их зависит от глубины расщепления белка. Пептон представляет собой порошок светло-желтого цвета, хорошо растворяется в воде, не свертывается при нагревании. Используется как источник азота и углерода.

При приготовлении сред все компоненты смешивают воде, греют или кипятят для растворения агар-агара, прозрачность придают путем фильтрования через ватно-марлевые или тканевые фильтры или осветляют добавлением куриного белка или свежей сыворотки крови, устанавливают рН среды с помощью индикаторов колориметрическим или электрометрическим способом и стерилизуют.

Классификация питательных сред

Питательные Транспортные Консервирующие

Естественные Искусственные

Синтетические

Простые Специальные Дифференциально- Элективные (Селективные)

диагностические

Плотные Жидкие

Естественные среды представляют собой природные субстраты (молоко, кровь, желчь, сыворотка, картофель). Искусственные содержат смесь природных органических веществ и продуктов их кислотного или ферментативного распада. Синтетические среды состоят из буферной солевой основы и растворов аминокислот, углеводов, пуринов, пиримидинов, нуклеотидов, нуклеозидов, жирных кислот, витаминов в точно установленных дозировках. В качестве источников азота в них используются аминокислоты. Достоинство этих сред в том, что они имеют постоянный состав, по ним можно определить потребности микробов в тех или иных питательных веществах.

Плотные питательные среды готовят из жидких с добавлением уплотнителя. В качестве уплотнителя обычно применяют агар-агар. Агар-агар – продукт, получаемый из морских водорослей, представляет собой желтоватый порошок или пластинки, содержит высокомолекулярные полисахариды, не расщепляется большинством микроорганизмов, не разрушается при автоклавировании, питательную ценность сред не изменяет, не подавляет рост микробов. Для иммунологических и бактериологических полей используется вымороженный, осветленный агар, который при кипячении или автоклавировании смеси порошка с водой расплавляется при температуре 85-100°С, а при охлаждении до 45-48°С образует гель.

Для приготовления, плотных питательных сред агар-агар добавляют в концентрации от 1,5 до 3%.

Простые среды.

Мясо-пептонный бульон (МПБ) является белковой основой всех сред. Существует несколько способов приготовления МПБ:

а) на мясной воде с добавлением готового пептона – это так называемый мясопептонный бульон;

б) на переварах продуктов гидролиза исходного сырья при помощи ферментов (трипсина – бульон Хоттингера, пепсина – бульон Мартена).

Мясо-пептонный агар (МПА) – получают путей добавления к МПБ arap-arapa (l,5-3%). Если МПА распределен по диагонали пробирки или флакона – это скошенный агар. Для его получения пробирки для застывания среды оставляют в наклонном положении. Если среда распределена в пробирке вертикально высотой 5-7 см, это агар столбиком. МПА, застывший в чашках Петри в виде пластинки – пластинчатый агар. Если среда имеет вертикальный слой высотой 2-3 см, и диагональный слой такой же величины, это полускошенный агар.

Специальные питательные среды – среды, на которых создаются условия для выращивания тех бактерий, которые не растут на простых средах. Кровяной агар или кровяной бульон – получают путем добавления к питательной среде 5-10% подогретой стерильной дефибринированной крови барана, кролика лошади, человека. Среда используется для выделения стрептококков, пневмококков и других бактерий, а также для изучения гемолитической активности. Сывороточный бульон или сывороточный агар получают, путем добавления к простым средам 15-20% лошадиной или бычьей сыворотки. Среда применяется для выделения пневмококков, менингококков. Желчный бульон или желчный агар получают путем добавления к питательной среде медицинской желчи без консерванта, или свежеполученной от крупного рогатого скота. Среда применяется для выделения брюшнотифозных, паратифозных и дизентерийных палочек. Специальные среды для культивирования анаэробных бактерий: среда Китта-Тароцци состоит из питательного бульона, глюкозы и кусочков печени или мясного фарша для адсорбции кислорода.

Желатин – животный белок, продукт частичного гидролиза коллагена. Имеет вид бесцветных или светло-желтых пластинок без запаха и вкуса. В холодной воде набухает, сильно поглощая воду. При температуре 30°С растворяется, при охлаждении до 20-22°С превращается в гель (студень). Используется в микробиологии для изучения протеолитических ферментов.

Дифференциально-диагностические среды позволяют различить один вид микроба от другого. Принцип построения дифференциально-диагностических сред основан на разной биохимической активности бактерий. В состав дифференциально-диагностических сред входит основная питательная среда, обеспечивающая размножение бактерий, определенный химический субстрат, различное отношение к которому является диагностическим признаком, индикатор, изменение цвета которого свидетельствует о разложении субстрата и образовании кислых продуктов.

Агар Эндо – плотная среда, применяется для выделения и первичной идентификации энтеробактерий. В состав ее входят, кроме питательной основы, лактоза и основной фуксин, обесцвеченный сульфитом и фосфатом натрия. Правильно приготовленная среда бесцветна или имеет слегка розовый оттенок. Колонии бактерий (кишечная палочка), ферментирующие лактозу, окрашиваются на ней в красный цвет; бактерии, не ферментирующие лактозу (сальмонеллы), остаются бесцветными.

Среда Левина (лактозоэозинметиленовый агар) – среда для выделения энтеробактерий. Колонии лактозоферментирующих бактерий окрашены в темно-синий или черный цвет, колонии лактозоотрицательных бактерий вырастают под цвет среды (светло-фиолетового цвета).

Среды Гисса – набор определенных углеводов для изучения ферментативной активности бактерий и их дифференциации по этим признакам.

Элективные питательные среды содержат дополнительные вещества, задерживающие рост грамположительных бактерий. Селективные питательные среды стимулируют рост одних микробов и угнетают рост других. Селективные условия получают путем добавления в среду химических веществ. Так как в этих средах патогенные бактерии размножаются и накапливаются, их называют также средами обогащения.

Среда Плоскирева – плотная питательная среда, содержащая соли желчных кислот, бриллиантовый зеленый, лактозу и индикатор. Эта среда является не только селективной, так как подавляет рост многих микробов и способствует лучшему росту возбудителей брюшного тифа, паратифов, дизентерии, но и дифференциально-диагностической, так как лактозоотрицательные бактерии (шигеллы) образуют на ней бесцветные колонии, а лактозоположительные – кирпично-красные.

Селенитовая среда - является лучшей средой обогащена для сальмонелл и дизентерийных микробов Зонне. Селенит натрии, содержащийся в среде, стимулирует рост этих бактерий и подавляет рост сопутствующей флоры.

Среда Мюллера служит для накопления сальмонелл. К питательной среде добавлют мел, раствор Люголя и гипосульфит натрия. При взаимодействии этих веществ образуется тетратионат натрия, который угнетает рост кишечных палочек, но создает благоприятные условия для размножения сальмонелл.

Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) – содержит соли висмута, бриллиантовую зелень. Сальмонеллы растут на этой среде в виде колоний чернота цвета. Другие виды бактерий на этой среде роста не дают.

Желточно-солевой агар (ЖСА) –среда для выделения стафилококков, содержит до 10% хлорида натрия, что подавляет большинство бактерий, содержащихся в материале. Кроме того, эта среда является и дифференциально-диагностической, так как присутствие яичного желтка позволяет выявить фермент лецитиназу (лецитовителлазу), который образуют патогенные стафилококки. Лецитиназа расщепляет лецитин на фосфорхолины и нерастворимые в воде жирные кислоты, поэтому среда вокруг лецитиназоположительных колоний мутнеет и появляется опалесцирующая зона в виде «радужного венчика».

Теллуритовые среды (сывороточно-теллуритовый агар, кровяно-теллуритовый агар) – селективные среды для выделения дифтерийных бактерий, содержат теллурит калия. Бесцветная соль теллура, содержащаяся в питательной среде, восстанавливается дифтерийными бактериями до металла, окрашивающего колонии в черный цвет.

Щелочной агар элективен для холерных вибрионов, щелочная реакция среды (рН 9,0) не препятствует росту холерных вибрионов, но тормозит рост других микроорганизмов.

Консервирующие среды – среды, содержат добавки, предупреждающие размножение и гибель микробов, что способствует сохранению их жизнеспособности. Консервирующие среды применяются когда нет возможности быстрого посева на питательные среды. Для бактерий наиболее употребительны консерванты:

а) глицериновая смесь, состоящая из 0,5 л химически чистого
глицерина и 1,0 л физиологического раствора.

б) боратная смесь

в) фосфатно-буферная смесь

Для длительного сохранения свежевыделенных и производственных культур применяют полужидкий голодный агар, в этой среде при пониженной жизнедеятельности микробов продукты обмена накапливаются незначительно, что способствует хорошему сохранению культур.

Специальные среды.

В бактериологии широко применяются сухие питательные среды промышленного производства, которые представляют собой гигроскопические порошки, содержащие все компоненты среды, кроме воды. Для их приготовления используются триптические перевары дешевых непищевых продуктов (рыбные отходы, мясокостная мука, технический казеин). Они удобны при транспортировке, могут длительно храниться, избавляют лаборатории от громадного процесса приготовления сред, приближают к разрешению вопроса о стандартизации сред. Медицинская промышленность производит сухие среды Эндо, Левина, Плоскирева, висмутсульфит агар, питательный агар, углеводы с индикатором ВР и другие.

Термостаты

Для культивирования микроорганизмов используют термостаты.

Термостат – это аппарат, в котором поддерживают постоянную температуру. Прибор состоит из нагревателя, камеры, двойных стенок, между которыми циркулирует воздух или вода. Температура регулируется терморегулятором. Оптимальная температура для размножения большинства микроорганизмов 37°С.

11. Условия успешной антибиотикотерапии. Отрицательные стороны антибиотикотерапии. Действие антибиотиков на микробы в зависимости от дозы препарата. Методы определения чувствительности микробов к антибиотикам.

Рациональная антибиотикотерапия

Врач всегда должен помнить, что назначать антибиотики следует только при инфекциях бактериальной этиологии. Выбор антибиотиков должен основываться на знании их природной активности в отношении предполагаемых или установленных возбудителей заболевания, а также на локальных и региональных данных о резистентности микроорганизмов. Следует назначать только препараты с доказанной клинической эффективностью при инфекциях данной локализации, обращая при этом внимание на форму выпуска, профиль безопасности, возможность межлекарственных взаимодействий и др.

Обеспечить высокую эффективность лечения может только своевременное начало антибактериальной терапии. Не менее важными являются адекватное дозирование, оптимальная длительность курса антибактериальной терапии и своевременная оценка эффективности стартового антибиотика (через 48-72 ч от начала лечения). Существенную роль играет и оптимальное соотношение стоимость/эффективность. При выборе препарата и проведении антибактериальной терапии обязательно учитываются особенности пациента (возраст, масса тела, физиологические состояния (беременность, период лактации), иммунодефицитные состояния, сопутствующие заболевания, поведенческие стереотипы и др.) и течение заболевания (локализация, клинические проявления, тяжесть и др.).

Отрицательные стороны антибиотикотерапии

Дисбактериоз: антибиотики убивают полезную и патогенную микрофлору. Выраженность дисбактериоза зависит от дозы, продолжительности, типа лекарства и возраста человека. Как правило, после основной болезни маленьким детям приходится восстанавливать микрофлору. Как этого избежать? Параллельно с антибиотиками (2–3 раза в день) и 2 недели после лечения пить пробиотики (эубиотики) – бактерии для микрофлоры кишечника. Тогда дисбактериоза не будет либо его проявления уменьшатся.
Опасно пить женщинам в первом триместре беременности. Но если имеется болезнь, угрожающая жизни матери и ребенку, врач выбирает наименьшее зло. Не рекомендуется принимать кормящим грудью женщинам.
Индивидуальная непереносимость, аллергия или побочные эффекты. Об этом необходимо уведомить врача перед назначением антибиотика или после назначения, если побочные явления появились впервые, и врач сменит лекарство.

Важное условие рациональной антибиотикотерапии - правильный выбор препарата и назначение достаточных доз, способных оказать пагубное действие на
микроорганизм. Назначение препарата в малых дозах может способствовать развитию резистентности микробов.

Определение чувствительности к антибиотикам

А) методом дисков.

На поверхность питательного агара засевают газоном испытуемую культуру (стафилококк, кишечная палочка). Чашки приоткрывают и подсушивают при комнатной температуре 10-15 минут. Затем накладывают диски пинцетом на расстоянии 2 см друг от друга и от краев чашки. Чашки помещают в термостат для инкубации на 18-20 часов, перевернутыми кверху дном, после чего учитывают результат. Чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность, учет проводят в отраженном свете. С помощью линейки и измерителя определяют диаметр зон задержки роста вокруг дисков, включая диаметр дисков. Оценку результатов проводят по таблицам, которые содержат пограничные значения диаметров зон задержки роста для устойчивых, умеренно устойчивых и чувствительных микроорганизмов.

Б) методом серийных разведении.

Этот метод является количественным, так как позволяет определить минимальную ингибирующую концентрацию, т.е. наименьшую концентрацию антибиотика, ингибирующую рост исследуемой культуры. Исследование начинают с приготовления основного раствора, из которого готовят все последующие разведения в бульоне (в объеме 1 мл), после чего к каждому разведению добавляют 0,1 мл исследуемой бактериальной суспензии, содержащей 10 6 -10 7 бактериальных клеток в 1 мл. Для контроля используют посев культуры на бульон без антибиотика. Посевы инкубируют при 37°С 18-20 часов. В контроле появится рост (пробирка станет мутной). Пробирки с прозрачной питательной средой указывают на задержку роста испытуемой культуры, а последняя пробирка с прозрачной питательной средой содержит наименьшую ингибирующую дозу антибиотика, определяющую степень чувствительности испытуемой культуры к антибиотику.

Процесс репродукции вирусов условно можно разделить на 2 фазы. Первая фаза включает 3 стадии : 1) адсорбцию вируса на чувствительных клетках; 2) проникновение вируса в клетку; 3) депротеинизацию вируса. Вторая фаза включает стадии реализации вирусного генома : 1) транскрипцию, 2) трансляцию, 3) репликацию, 4) сборку, созревание вирусных частиц и 5) выход вируса из клетки.

Взаимодействие вируса с клеткой начинается с процесса адсорбции, т. е. с прикрепления вируса к поверхности клетки.

Адсорбция представляет собой специфическое связывание вирионного белка (антирецептора) с комплементарной структурой клеточной поверхности — клеточным рецептором. По химической природе рецепторы, на которых фиксируются вирусы, относятся к двум группам: мукопротеидным и липопротеидным. Вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы фиксируются на мукопротеидных рецепторах. Энтеровирусы, вирусы герпеса, арбовирусы адсорбируются на липопротеидных рецепторах клетки. Адсорбция происходит лишь при наличии определённых электролитов, в частности ионов Са2+, которые нейтрализуют избыточные анионные заряды вируса и клеточной поверхности и уменьшают электростатическое отталкивание Адсорбция вирусов мало зависит от температуры Начальные процессы адсорбции носят неспецифический характер, являются результатом электростатического взаимодействия положительно и отрицательно заряженных структур на поверхности вируса и клетки, а затем наступает специфическое взаимодействие прикрепительного белка вириона со специфическими группировками на плазматической мембране клетки. Простые вирусы человека и животных содержат прикрепительные белки в составе капсида. У сложно организованных вирусов прикрепительные белки входят в состав супер-капсида. Они могут иметь форму нитей (фибры у аденовирусов), либо шипов, грибоподобных структур у миксо-, ретро-, рабдо- и других вирусов. Вначале происходит единичная связь вириона с рецептором — такое прикрепление непрочное — адсорбция носит обратимый характер. Чтобы наступила необратимая адсорбция, должы появиться множественные связи между рецептором вируса и рецептором клетки, т. е. стабильное мультивалентное прикрепление. Количество специфических рецепторов на поверхности одной клетки составляет 10 4 -10 5 . Рецепторы для некоторых вирусов, например, для арбовирусов. содержатся на клетках как позвоночных, так и беспозвоночных, для других вирусов только на клетках одного или нескольких видов.

Проникновение вирусов человека и животных в клетку происходит двумя путями: 1) виропексисом (пиноцитозом); 2) слиянием вирусной суперкапсидной оболочки е клеточной мембраной. Бактериофаги имеют свой механизм проникновения, так называемый шприцевои, когда в результате сокращения белкового отростка фага нуклеиновая кислота как бы впрыскивается в клетку.

Депротеинизация вируса освобождение геиома вируса от вирусных защитных оболочек происходит либо с помощью вирусных ферментов, либо с помощью клеточных ферментов. Конечными продуктами депротеинизации являются нуклеиновые кислоты или нуклеиновые кислоты, связанные с внутренним вирусным белком. Затем имеет место вторая фаза вирусной репродукции, ведущая к синтезу вирусных компонентов.

Транскрипция — переписывание информации с ДНК или РНК вируса на и-РНК по законам генетического кода.

Трансляция — процесс перевода генетической информации, содержащейся в и-РНК, на специфическую последовательность аминокислот.

Репликация — процесс синтеза молекул нуклеиновых кислот, гомологичных вирусному геному.

Реализация генетической информации у ДНК-содержащих вирусов идёт так же, как и в клетках:

ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок

РНК транскрипция и-РНК трансляция белок

У вирусов с позитивным РНК-геномом (тогавирусы, пикорнавирусы) транскрипция отсутствует:

РНК трансляция белок

У ретровирусов — уникальный путь передачи генетической информации:

РНК обратная транскрипция ДНК транскрипция и-РНК трансляция белок

ДНК интегрируется с геномом клетки-хозяина (провирус).

После наработки клеткой вирусных компонентов наступает последняя стадия вирусной репродукции сборка вирусных частиц и выход вирионов из клетки. Выход вирионов из клетки осуществляется двумя путями: 1) путём «взрыва» клетки, в результате чего клетка разрушается. Этот путь присущ простым вирусам (пикорна-, рео-, папова- и аденовирусам), 2) выход из клеток путём почкования. Присущ вирусам, содержащим суперкапсид. При этом способе клетка сразу не погибает, может дать многократное вирусное потомство, пока не истощатся её ресурсы.

Методы культивирования вирусов

Для культивирования вирусов в лабораторных условиях используются ледуюшие живые объекты: 1) культуры клеток (тканей, органов); 2) куриные мбрионы; 3) лабораторные животные.

Культуры клеток

Наибольшее распространение имеют однослойные культуры клеток, которые можно разделить на 1) первичные (первично трипсинизированные), 2) полуперевиваемые (диплоидные) и 3) перевиваемые.

По происхождению они классифицируются на эмбрионштьные, опухолевые и из взрослых организмов; по морфогенезу — на фибробластные, эпителиальные и др.

Первичные культуры клеток — это клетки какой-либо ткани человека или животного, которые имеют способность расти в виде монослоя на пластмассовой или стеклянной поверхности, покрытой специальной питательной средой. Срок жизни таких культур ограничен. В каждом конкретном случае их получают из ткани после механического измельчения, обработки протеолитическими ферментами и стандартизации количества клеток. Первичные культуры, полученные из почек обезьян, почек эмбриона человека, амниона человека, куриных эмбрионов, широко используются для выделения и накопления вирусов, а также для производства вирусных вакцин.

Полуперевиваемые (или диплоидные ) культуры клеток — клетки одного типа, способные in vitro выдерживать до 50-100 пассажей, сохраняя при этом свой исходный диплоидный набор хромосом. Диплоидные штаммы фибробластов эмбриона человека используются как для диагностики вирусных инфекций, так и при производстве вирусных вакцин.

Перевиваемые клеточные линии характеризуются потенциальным бессмертием и гетероплоидным кариотипом.

Источником перевиваемых линий могут быть первичные клеточные культуры (например, СОЦ, ПЭС, ВНК-21 — из почек однодневных сирийских хомяков; ПМС — из почки морской свинки и др.) отдельные клетки которых обнаруживают тенденцию к бесконечному размножению in vitro. Совокупность изменений, приводящих к появлению из клеток таких особенностей, называют трансформацией, а клетки перевиваемых тканевых культур — трансформированными.

Другим источником перевиваемых клеточных линий являются злокачественные новообразования. В этом случае трансформация клеток происходит in vivo. Наиболее часто в вирусологической практике применяются такие линии перевиваемых клеток: HeLa — получена из карциномы шейки матки; Нер-2 — из карциномы гортани; Детройт-6 — из метастаза рака лёгкого в костный мозг; RH — из почки человека.

Для культивирования клеток необходимы питательные среды, которые по своему назначению делятся на ростовые и поддерживающие. В составе ростовых питательных сред должно содержаться больше питательных веществ, чтобы обеспечить активное размножение клеток для формирования монослоя. Поддерживающие среды должны обеспечивать лишь переживание клеток в уже сформированном монослое при размножении в клетке вирусов.

Широкое применение находят стандартные синтетические среды, например, синтетическая среда 199 и среда Игла. Независимо от назначения все питательные среды для культур клеток конструируются на основе сбалансированного солевого раствора. Чаще всего им является раствор Хенкса. Неотъемлемый компонент большинства ростовых сред — сыворотка крови животных (телячья, бычья, лошадиная), без наличия 5-10% которой размножение клеток и формирование монослоя не происходит. В состав поддерживающих сред сыворотка не входит.

Выделение вирусов в культурах клеток и методы их индикации.

При выделении вирусов из различных инфекционных материалов от больного (кровь, моча, фекалии, слизистые отделяемые, смывы из органов) применяют культуры клеток, обладающие наибольшей чувствительностью к предполагаемому вирусу. Для заражения используют культуры в пробирках с хорошо развитым монослоем клеток. Перед заражением клеток питательную среду удаляют и в каждую пробирку вносят по 0,1-0,2 мл взвеси испытуемого материала, предварительно обработанного антибиотиками для уничтожения бактерий и грибов. После 30-60 мин. контакта вируса с клетками удаляют избыток материала, вносят в пробирку поддерживающую среду и оставляют в термостате до выявления признаков размножения вируса.

Индикатором наличия вируса в заражённых культурах клеток может служить:

1) развитие специфической дегенерации клеток — цитопатическое действие вируса (ЦПД), которое имеет три основных типа: кругло- или мелкоклеточная дегенерация; образование многоядерных гигантских клеток — симпластов; развитие очагов клеточной пролиферации, состоящих из нескольких слоев клеток;

2) обнаружение внутриклеточных включений, располагающихся в цитоплазме и ядрах пораженных клеток;

3) положительная реакция гамагтлютинации (РГА);

4) положительная реакция гемадсорбции (РГАдс);

5) феномен бляшкообразования: монослой зараженных вирусом клеток покрывается тонким слоем агара с добавлением индикатора нейтрального красного (фон — розовый). При наличии вируса в клетках образуются бесцветные зоны («бляшки») на розовом фоне агара.

6) при отсутствии ЦПД или ГА можно поставить реакцию интерференции: исследуемая культура повторно заражается вирусом, вызывающим ЦПД. В положительном случае ЦПД будет отсутствовать (реакция интерференции положительная). Если в исследуемом материале вируса не было, наблюдается ЦПД.

Выделение вирусов в куриных эмбрионах.

Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста.

Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоско-пировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом и спиртом.

Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.

Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.

III. Выделение вирусов на лабораторных животных.

Лабораторные животные могут быть использованы для выделения вирусов из инфекционного материала, когда невозможно применить более удобные системы (культуры клеток или куриные эмбрионы). Берут преимущественно новорождённых белых мышей, хомяков, морских свинок, крысят. Заражают животных по принципу цитотропизма вируса: пневмотропные вирусы вводятся интраназально, нейротропные — интрацеребрально, дерматотропные — на кожу.

Индикация вируса основана на появлении признаков заболевания у животных, их гибели, патоморфологических и патогистологических изменений в тканях и органах, а также по положительной реакции гемагглтотинации с экстрактами из органов.